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1、无形体病标本采集运送 及实验室检测,武汉市疾病预防控制中心微检科 曾莹春2009.07.02，武汉,标本采集运送,标本采集对象： 疑似病例 密切接触者或其他健康人群 疫源地可疑宿主动物（野生动物及狗、羊、牛等家畜）、媒介蜱。,标本采集运送,标本的种类： 疑似病例血液: 病人血液（抗凝血&非抗凝血） 人粒细胞无形体病尸检标本:病人脾脏、肝脏各1克X3份。 密切接触者或其他健康人群血：5mLX1份 可疑野生动物及狗、羊、牛、吸血蜱、不吸血蜱的脾脏、肝脏各1克X3份。,不同标本的采集技术,无菌采集。 抗凝血标本：常用EDTA 抗凝管或枸橼酸盐抗凝管采集血液5ml，用于病原分离。应尽可能在病人使用抗生
2、素前进行血液的采集。 非抗凝血标本：用标准无菌真空管，用于血清抗体及PCR 检测。采集后，应及时分离血清，将血清、血球分别保存。 PS-血清标本：不加任何抗凝剂。血清学检测需采集急性期与恢复期双份血清（至少间隔3周）。如果不能及时检测，应储存在-70或液氮中。如果恢复期标本没有4倍升高，应建议医生采集第三份血（至少间隔2周）。尽量避免溶血。,不同标本的采集技术,采集动物体表媒介蜱，用镊子夹取，放入铺垫有潮湿滤纸或纱布的青霉素小瓶或试管中，用纱布包紧瓶口以防止蜱爬出。,标本运送,B类包装同时附流调资料、病历资料标本运送 温度： 0- 4度,标本灭活、病原DNA 标本提取及病原体分离操作应在生物安
3、全级实验室进行。非感染性材料的检测可在生物安全I 级实验室进行。,血细胞染色检查包涵体,厚血片法。国际血液学标准化委员会推荐罗氏Romanowsky)染色为标准染色法。国内主要采用瑞氏（Wright)染色法、姬氏（Giemsa)染色法或瑞姬（W-G)混合染色法。染料加磷酸盐控制其PH值，可克服使用瑞氏、姬氏染色中存在的缺点。,Wright-Giemsa （中性粒细胞中可见桑葚状包涵体）,血清学检测方法,间接免疫萤光实验(IFA)采集急性期与恢复期双份血清，推荐国际质量认证（ISO）的商业产品（FOCUS)作间接免疫荧光试验。,FOCUS KIT,微量间接免疫荧光法,采集急性期与恢复期双份血清，
4、推荐国际质量认证（ISO）的商业产品（FOCUS)作间接免疫荧光试验。IFA检测结果按说明书进行,结果观察,IFA检测HGAIgM抗体阳性结果（感染细胞胞浆内可见黄绿色荧光包涵体）,IFA检测HGAIgM抗体阴性结果（感染细胞胞浆内无黄绿色荧光包涵体）,间接免疫荧光法结果判断,急性期血清：IgM 1:32, IgG 1:64 有参考意义。 恢复期双份血清: IgM或IgG四倍增长有诊断参考意义。,抗体交叉现象,斑点热： 埃立克体病： 嗜吞噬无形体： Q热： 立克次体：斑疹伤寒,分子生物学方法,基于多聚酶链反应(PCR)的技术 基于分子杂交原理的技术 基于核酸序列分析的技术,病毒的检测定量定性基
5、因型及基因突变 细菌及其它微生物的检测难培养菌耐药基因 寄生虫的检测,分类,用途,分子生物学检测方法的优势,血清学诊断在发病一周内往往检测不到抗体,而病原分离操作复杂,且分离率十分低。以PCR 扩增及测序为主要手段的分子生物学技术目前已取代病原分离作为直接诊断依据。,16SrRNA基因检测： PCR检测无形体最常用的扩增基因是16SrRNA，该方法已在国际上普遍应用并得到良好的方法学评估。采用无形体及埃立克体属通用引物及种特异分型引物同时进行检测,可以区分无形体与埃立克体。但要特别注意PCR检测应分区进行，避免污染。,无形体PCR检测（巢式PCR）,巢式PCR,为提高PCR 方法的特异性,目前
6、巢式PCR 已普遍取代常规PCR。如17KD 、gltA 、ompB 、56KD， 巢式PCR 分别被用来检测斑疹伤寒群和斑点热群、恙虫病立克次体、无形体。,巢式PCR 当靶基因表达量较低或常规PCR无法得到理想的扩增产物时，对靶基因进行第二次扩增以获得足够和特异的扩增产物。,无形体及埃立克体巢氏PCR检测 16SrRNA基因常用引物,通用引物,埃立克体,无形体,无形体,举 例-无形体PCR扩增,引物外引物Eh-OUT1和Eh-OUT2内引物HGA3和HGA4(本实验室设计）,DNA抽提 材料 疑似病例的全血标本 QIAGEN公司的DNA提取试剂盒抽提总DNA,巢式PCR扩增,序列分析,序列分析,结果分析,利用Blast经过序列比对，确定PCR扩增的核酸片段是否与来自无形体的DNA片段同源。 将16s rRNA作为PCR扩增的靶基因，具有高灵敏性，但特异性较差。 可采用具有种属特异性的热休克蛋白基因groEL进行扩增,groEL 扩增 引物,无形体病结果分析,IgM抗体阳性+核酸:确诊 IgG抗体阳性+核酸:确诊 IgG抗体四倍增长+核酸:确诊 抗原阳性+ IgM抗体阳性:确诊 抗原阳性+ IgG抗体阳性:确诊 病原阳性:确诊 IgM抗体阳性+包涵体:确诊 IgG抗体阳性+包涵体:参考意义 IgG抗体四倍增长+包涵体:参考意义,内容介绍完毕,祝各位同仁开心工作每一天!,
