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1、肿瘤的基因诊断,温州医学院检验医学院 温州医学院附一医检验科 陶 志 华,肿瘤是细胞的异常增生有结构、功能和代谢的异常具有超过正常细胞增生能力,肿瘤概念,在细胞内核酸代谢的异常:肿瘤细胞和正常细胞的核酸代谢有显著的不同；不同类型肿瘤细胞的核酸代谢也有较大的差异；相同恶性程度肿瘤细胞的核酸代谢也有所不同。,肿瘤是一种分子病,癌基因的激活抑癌基因的失活（或缺失）,肿瘤发生机理,原癌基因 癌基因 病毒癌基因肿瘤抑制基因肿瘤转移相关基因肿瘤耐药基因等,肿瘤相关基因,细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的基因癌基因在正常细胞的基因组中存在不表达状态表达水平不足以引起细胞的恶性转化,癌基因：,表1细
2、胞癌基因按其产物定位和功能分类,能够抑制细胞恶性转化或抑制细胞异常增殖的基因目前研究较多的有p53基因、pRB基因、p16蛋白、p15蛋白、p21等。,抑癌基因,表2 已确定的几种抑癌基因,野生型P53生物学活性,当DNA损伤的时候,P53基因就明显表达使细胞在G1期生长阻滞，促使细胞凋亡。抑制肿瘤细胞生长保持DNA完整性,包括肿瘤转移促进基因或肿瘤转移抑制基因。,肿瘤转移相关基因,其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的基因。,肿瘤耐药基因,血小板衍生生长因子（PDGF）表皮生长因子（EGF）VGF基因等,肿瘤生长因子,肿瘤的基因诊断,肿瘤的基因诊断目前主要集中在以下几个方面： 肿瘤转移标志物 肿瘤
3、抗药基因 突变的癌基因 肿瘤相关的病毒基因,表3 肿瘤基因诊断的分子标志及其应用, 可分为四大类 组织特异性基因标志 肿瘤特异性基因标志 血管生成因子 其它与肿瘤转移相关的分子及基质蛋白酶及其抑制剂,肿瘤转移基因标志物,组织特异性基因标志物,指肿瘤组织和/或起源正常组织所特有，在淋巴组织和血细胞中不存在的。如角质蛋白家族（CK）mRNA、粘蛋白基因、表皮生长因子受体（EGFR）mRNA等。 .,肿瘤特异性基因标志物,存在于肿瘤及其起源的正常细胞中，不存在于其他细胞。 如CEA mRNA、AFP mRNA、PSA mRNA等。,血管生成因子,如血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。,肿瘤抗药基因,
4、对于肿瘤化疗效果及预后进行推测； 还可以将肿瘤抗药基因导人骨髓细胞，特别是骨髓干细胞中，提高机体对于抗肿瘤化疗药物的耐受程度，如此可以加大抗肿瘤化疗药物的使用剂量，提高抗肿瘤化疗的治疗效果。,肿瘤抗药基因,多药抗性基因一l（MDR1），其编码的蛋白如P-糖蛋白起排流泵作用。 . 其它一些与细胞内药物代谢有关的基因也可以看作是肿瘤抗药基因，如谷胱苷肽S一转移酶（GST），可使机体解毒功能增强；癌基因 bcl-2的表达可抑制肿瘤化疗药物所诱导的肿瘤细胞程序化死亡等。 .,突变的癌基因,癌基因的突变是癌基因激活的重要方式和途径。除了见到较大范围片段的缺失或插人以及染色体转位之外，大多数情况下，都是少
5、数核苷酸或单个碱基的突变。 . 癌基因点突变的检测单链构象多态性（SSCP）检测技术等 .,肿瘤相关的病毒基因,EB病毒（EBV） 人乳头瘤病毒（HPV） 乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染,对于这些肿瘤组织细胞中相关病毒基因及其编 码产物的检测，可以作为这些类型的肿瘤诊断的标志。,致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们极大的关注,肿瘤基因诊断的常用方法,PCR、RT-PCR Southern blot杂交技术、Northern blot杂交技术 基因芯片 基因测序。,肿瘤基因的分子诊断意义,1.肿瘤的早期诊断和筛选 2.肿瘤疗效监测 3.肿瘤的预后判断 4.肿瘤微转移检测,肿瘤
6、基因检测在肿瘤微转移检测中 应用举例,前列腺癌特异性基因DD3PCA3,DD3PCA3是一种非编码RNA的基因，定位于9q2122染色体。它为前列腺癌特异性基因之一，DD3PCA3 mRNA仅在前列腺癌细胞中表达，而在其它正常组织和癌组织以及细胞系中均不表达。,DD3 mRNA 14外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤
7、；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。,DD3 mRNA 13外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。,DD3 mRNA 34外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对
8、照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。,前列腺组织和其他肿瘤组织及癌旁组织DD3 mRNA检测结果,M：50bp DNA标准；1：LNCaP阳性对照；2：BPH；3：健康男性志愿者；410为PCa；11为试剂空白。,外周血DD3 mRNA的RT-PCR扩增电泳图,RT-PCR检测结果,44例PCa组中13例可见
9、DD3 mRNA阳性结果(其中B期、C期及D期分别有为0例、2例，11例)。 30例BPH患者和18名健康男性志愿者标本中均未检出DD3 mRNA。,外周血DD3 mRNA的巢式RT-PCR扩增电泳图,M：50bp DNA分子量标准；1：LNCaP阳性对照；2：阴性对照(女性)；3：BPH患者； 4：健康男性志愿者；58：未治疗的PCa；9：试剂空白,巢式RT-PCR检测结果,44例PCa组中21例可见DD3 mRNA阳性结果(其中B期、C期、D期分别有1例、5例、15例) 30例BPH患者和18名健康男性志愿者均未见阳性结果,两种方法对PCa患者外周血DD3 mRNA检出率比较,外周血DD3 mRNA巢式RT-PCR方法的灵敏度,M:50bp DNA分子量标准；16:依次为105、104、103、102、101、1个LNCaP细胞/ml全血； 7:阴性对照；8:试剂空白,不同前列腺疾病患者其外周血DD3 mRNA检出率比较,巢式RT-PCR,PCa不同临床分期未治疗组和治疗组DD3 mRNA阳性率比较(%,例数),巢式RT-PCR,谢 谢 !,
