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1、结核病实验室检查,柳正卫,目录,中国结核病防治规划实施工作指南2008版 新指南中对结核病实验室的要求 结核病实验室检查要求 分枝杆菌分离培养 痰涂片检查的登记报告 痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册 痰涂片镜检标准化操作 痰涂片镜检质量保证 生物安全,中国结核病防治规划实施工作指南2008版,DOTS策略,对所有肺结核病症状可疑者使用痰涂片检查,发现传染性肺结核病人。,我国结核病控制策略二,提高发现和治疗肺结核患者工作质量 加强实验室能力建设 实验室的建设，改善各级结核病实验室工作条件 开展培养和药敏试验 质量控制 技术指导 研究能力 生物安全管理和感染控制 中国结核病防治规划实施工作指南2
2、008版,各级实验室的职责,省级参比实验室 实施和推广国家结核病实验室诊断标准和操作规程，对结核病实验室工作进行技术指导、评价；制定培训计划，开展相关培训； 地市级实验室 实施和推广国家结核病实验室诊断标准和操作规程；制定培训计划，开展相关培训；县级实验室 开展痰涂片检查工作，根据当地实际情况逐步开展结核分枝杆菌的分离培养； 乡镇卫生院（社区卫生服务中心） 开展痰涂片检查工作,实验室的建设,房屋设置 实验室：各级根据工作需要，保证实验室用房达到生物安全标准。,结核病细菌学实验室布局原则,结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得与其他实验室混用。培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片镜检、培养前处
3、理、药敏试验等污染操作要有独立分开的场所，最好分别在专用的房间进行。,各级实验室需要的设备参考清单,实验室生物安全（略）,结核病实验室检查要求,痰盒,统一使用螺旋盖、可密封、广口的塑料痰盒收集痰标本。 医务人员在容器上应注明患者姓名、编号（门诊序号或登记号）、检查项目、痰标本序号1、2、3（1为即时痰，2为夜间痰，3为次日晨痰）,标本采集,痰标本 即时痰 晨痰 夜间痰 痰采集方法宣教 患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量（特别是用于初次诊断的痰标本）。标本量一般在35 ml。,留痰场所,由于患者咳嗽、咳痰时，易产生含有结核菌的飞沫，感染周边人群的机率较高，故采集痰标本时
4、应在远离人群的开放空间进行，或在通风良好的室内进行。,一个喷嚏可使飞沫以167公里的时速运行，在1秒内到达6米外的地方,痰标本性状,标本性状按照国家实验室质量控制新标准，分为干酪痰（A）、血痰（B）、粘液痰（C）和唾液（D） 合格的痰标本一般为干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰。痰标本不合格时，应进一步指导并要求患者重新送检。,直接痰涂片检查,检查对象 确定诊断，发现传染源； 肺结核患者、疑似肺结核患者和肺结核可疑症状者 疗效评价，作为确定化疗方案和治疗效果评价的指标。 已确诊、登记和治疗的肺结核患者,直接痰涂片检查,痰涂片的制备 为了保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时，对
5、载玻片进行加热 。 涂抹完毕后的痰标本，在结果报告前应暂时保留。 萋尔尼尔逊染色法（Ziehl-Neelson） 镜检 由于香柏油能够溶解复红染料，使萋尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害；故应该使用专门用于100油镜、不干燥、不变硬且粘度适宜的镜油。,结果报告,萋尼氏染色镜检结果分级报告标准 抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。 报告抗酸杆菌菌数：18条抗酸杆菌/300视野。 抗酸杆菌阳性（1）：39条抗酸杆菌/100视野。 抗酸杆菌阳性（2）：19条抗酸杆菌/10视野。 抗酸杆菌阳性（3）：19条抗酸杆菌/每视野。 抗酸杆菌阳性（4）：10条抗酸杆菌/每视野
6、。报告“1+”时至少观察300个视野，报告“2+”时至省观察100个视野，报告“3+”、“4+”时至少观察50个视野。,玻片的保存,萋尼氏染色玻片阅读完毕后，应及时使用擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。 经脱油、干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检或质控抽检。 荧光染色的玻片，玻片盒中放置干燥剂后密封放置在4冰箱保存。 荧光染色涂片质控时，应首先将复检涂片进行萋尼氏染色后，重新阅读。,分枝杆菌培养,分枝杆菌培养主要用于确定诊断、耐药监测和药物敏感性试验。,确定诊断,临床表现或胸部X线检查怀疑肺结核，但直接涂片检查结果为阴性的患者，可以进行培养
7、检查以进一步明确诊断。确定诊断的培养检查应采集2个合格的痰标本，即“夜间痰”和“晨痰”送检。,耐药监测,耐药监测的培养是以获得分枝杆菌纯培养物用于药敏试验为目的，故一般选择涂片检查阳性患者的标本进行培养。患者用于涂片的3份痰标本中选择2份做培养： 3份痰标本均为阳性：选取阳性级别高的2份痰标本进行培养； 3份痰标本2份阳性：选取2份阳性痰标本进行培养； 3份痰标本1份阳性：选取阳性标本和1份质量好的阴性标本进行培养,药物敏感性试验,抗结核药物敏感性试验是诊断耐药结核病以及指导结核病治疗的有效手段。抗结核药物敏感性试验统一采用比例法。 诊断耐药结核病：可以选择复治涂阳肺结核患者、慢性肺结核患者、
8、初治失败肺结核患者以及治疗3月末痰菌仍阳性的初治肺结核患者进行药物敏感性试验。 选择结核病治疗方案：通过药物敏感性试验，确定结核病治疗方案。 耐药监测：通过有计划地组织抽样调查或哨点监测，了解某一地区的结核分枝杆菌的耐药水平。,痰涂片检查的登记报告,痰涂片检查登记本,痰涂片镜检质量保证,实验室细菌学检查是诊断传染性肺结核的关键。为保障相应检查项目结果的可靠性，要求相应的检查项目应该由经过培训并考核合格的专职人员完成，且开展相应检查的实验室应具备安全操作设施并制定实验室内部质量控制措施。在实验室内部质量控制的基础上，必须应用实验室室间质量检查和评估的方法，对实验室检查系统进行评价，同时接受专业结
9、核病参比实验室的室间质量保证（External quality assurance，EQA）督导和培训 。,新规划指南中涂片镜检质量保证,新版痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册,痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册,手册名称 体例编排 第一章 第二章 第三章 第四章,手册名称,旧版：中国结核病防治规划痰涂片镜检质量保证手册新版：中国结核病防治规划 痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册,名称：添加“标准化操作” -更准确地描述手册的内容,体例编排,旧版： 第一章 绪论 第二章 痰涂片检查 第三章 痰涂片镜检实验室质量保障新版 第一章 绪论 第二章 痰涂片镜检标准化操作 第三章 痰涂片镜检质量保障 第
10、四章 报表（新增） 附件 名词解释、试剂配制、盲法复检抽片示例,第一章 概论,旧版、新版均为概论，基本相同。 目的 是提供标准化操作程序，为评估实验室工作的质量和结果的可靠性提供指南和方法,第二章 痰涂片显微镜检查标准化操作,痰涂片检查的目的及优势 痰涂片检查对象 痰标本的采集 直接涂片抗酸染色显微镜检查标准化操作程序 荧光染色显微镜检查法 玻片的保存 抗酸菌痰检注意事项 显微镜的使用、维护和保养 试剂和材料,痰涂片检查的目的及优势,目的 (一) 诊断传染性肺结核 (二) 评价化疗效果 (三) 为流行病学疫情评价服务 优势 作为诊断手段，对传染性肺结核的诊断比X线的准确性高； 技术相对简单，容
11、易标准化和完成操作； 建立AFB检查时需设备投入少； 检查成本低，易于接受； 从收到标本到报告结果的时间短，能够满足临床诊断的需要； 对涂阳患者的治疗效果，能够作出及时和准确的评价,分枝杆菌的分类、萋尼氏染色原理及显微镜下形态,结核分枝杆菌复合群（M.tuberculosis complex, MTC）,临床上结核病的病原菌多为结核分枝杆菌、其次为牛分枝杆菌 非结核分枝杆菌（Nontuberculosis mycobacterium, NTM），大多数存在于自然环境中，属于条件致病菌。 萋尼氏(Z-N)染色法基本原理是：抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物性状。此类细菌在石炭酸（苯酚）的协同作用下
12、，被复红染色剂着色，能够耐受酸性酒精脱色，显微镜观察时保持红色；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色后，可被复染剂亚甲兰染为蓝色。AFB抗酸染色特性还与菌体细胞结构的完整性有着密切联系。 镜下形态变化较多,荧光染色显微镜检查法,显微镜检查 首先以10目镜、20物镜进行镜检，发现疑为AFB的荧光杆状物质，使用40物镜确认。 在暗背景下，抗酸菌发出黄色荧光，呈杆状略弯曲,荧光染色镜检结果分级报告标准,荧光染色抗酸杆菌阴性 (-)：0条/50视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性(报告抗酸菌数)：19条/50视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性(1+)：1049条/50视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性(2+)：
13、19条抗酸菌/1视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性(3+)：1099条抗酸菌/1视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性(4+)：100条及以上抗酸菌/1视野。报告2至少观察50个视野，3+及以上的阳性结果至少观察20个视野。,玻片的保存,萋尼氏染色玻片阅读完毕后，应及时用擦镜纸轻轻在涂片上揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。经脱油、干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中避光保存，以备复检或质控抽检。 荧光染色的玻片，玻片盒中放置干燥剂后密封放置在4冰箱避光保存。 荧光染色的涂片进行盲法复检复核时，应首先将复检涂片脱色后进行萋尼氏染色后，重新阅读。,涂片染色镜检制备注意事项,一张
14、载玻片上只能涂抹一份痰标本。 每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片检查。 涂抹后的痰膜不能太厚或者太薄，透过痰膜看报纸上的5号字时，字迹较模糊为适宜的厚度；看不见5号字或很清晰，则表明该玻片涂抹过厚或过薄。 由于香柏油能够溶解复红染料，使萋尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害；故禁止使用香柏油，必需使用显微镜专用的镜油。镜油折射系数（RI）应大于1.5，20黏度系数应在100-120mPas之间。 采用荧光染色法镜检AFB，只限于那些工作量较大(每人日读片数超过25张)、具备荧光显微镜、且镜检人员接受过荧光染色镜检培训的实验室开展。 采用荧光染色时，荧光随着时间而衰
15、减。故荧光染色后的涂片应于当日镜检；如果玻片数量过多，应将涂片放置于4避光保存，次日必须完成镜检。,AFB痰检假阳性结果的预防措施,必须使用新玻片进行涂片检查。 每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。 所有染液均经过滤。 染色时玻片彼此保持一定距离，相互彻底分隔开。 严禁使用染色缸染色。 染色时勿使玻片上的染液干燥。 滴加染色液或镜油时，避免容器滴口直接接触痰膜。 严禁物镜镜头直接接触痰膜。 作为对照，可采用已知结果为阴性的玻片完成染色镜检过程。 完整、准确的标注痰盒、玻片和登记实验登记本。 登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。 准确记录和报告结果。,AFB痰检假阴性结果的预防措施
16、,确认标本是痰而非唾液。 确认每份标本至少有3ml。 选择脓样、干酪样、粘液分泌物涂抹制备玻片。 制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。 使用高质量染料、严格按照配方配制染液。 严格按照操作程序完成染色过程。 判断结果为“阴性”前，必须阅读规定要求的视野数。 作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色镜检过程。 完整、准确的标注痰盒、玻片和实验登记本。 登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。 准确记录和报告结果。,第三章痰涂片显微镜检查质量保证,室内质量控制(Quality Control，QC) 室间质量评估（External Quality Assessment, EQA） 质量提高（Quality Improvement, QI）。,室内质控部分,痰涂片保存： 脱油要求： 不用二甲苯，用擦镜纸擦取涂片保存量要求： 弃旧存新、保存近期3个月、年涂片量不足500全部保留，另添加近3个月超过1000张，按照弃旧存新保存近期1000张 装满涂片的玻片盒，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间,
