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1、免疫组织化学技术 的原理及方法,目录,一. 基本知识 二. 基本原理 三. 方法 四. 结果的判断及异常着色原因分析和对策 五.临床意义,一、免疫组化技术的基本知识,一、免疫组化技术的基本知识,免疫组化的基本概念免疫组化，是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。,一、免疫组化技术的基本知识,抗体与抗原能特异性结合
2、生物学结合是免疫球蛋白Ig 抗原两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白质具有抗原性,免疫球蛋白的化学结构,免疫球蛋白根据重链结构命名IgG(),IgA()，IgD(),IgE(), IgM() 五种免疫球蛋白只有两种类型的轻链，即：Kappa()和Lambda()每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗体分子决不可能既有链又有链。这一点在免疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。,免疫球蛋白的化学结构,Fc(Fragment crystalline)是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片段，因其纯化时呈结晶状态而名之，该片段与抗原特异性有关Fab(Fragment antigenbingding)该端是抗体
3、与抗原特异性结合的部位，每分子Ig能结合2个抗原分子,多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生,多克隆抗体：多株B细胞针对多个抗原决定簇产生的抗体 单克隆抗体：针对某一抗原决定簇，由单株淋巴细胞（克隆）所产生的抗体,多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生,多克隆抗体的产生 以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断 中，有利划归肿瘤的基本类型。常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目录 上常以RaH（Rabbit against Human）表之。多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用至关重要。,多克隆抗
4、体与单多克隆抗体及其产生,单克隆抗体的产生应用细胞融合的杂交瘤（Hybridization），以针对单一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细胞（肿瘤性B细胞）融合形成杂交瘤，其特点是既能产生特异性抗体，又能在体外无限地增殖。将瘤细胞在体外培养或注入小鼠腹腔内而获单克隆抗体，由此产生的小鼠抗人（抗原）的抗体常以MaH表示，现在亦有兔的单克隆抗体。,抗原的制备： 传统用蛋白提纯 近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因结构，用其合成多肽，作为抗原，如ER、PR抗原的制备 现有兔的单抗,多克隆抗体的选用 1、单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。 2、单克隆抗体的特异性
5、强，多克隆抗体则敏感性高，如何选用完全决定于使用的目的性。,标记抗体,1、在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到 2、标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明酶：辣根过氧化酶，碱性磷酸酶金属离子：胶体金颗粒 3、标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性，从而使染色敏感性降低,酶 抗酶抗体复合物,通过免疫反应而不是化学方法，将酶结合到抗体上，形成具酶活性的免疫复合物。如PAP复合物（PeroxidaseAntiPeroxidaseComplex），PAP复合物属非标记性，保护了酶的活性，比免疫荧光法敏感上千倍。,酶标亲和素,在AB复合物中，酶是标记在生
6、物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感,多聚物载体,1、 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用 2、 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物,二、免疫过氧化物酶染色技 术的基本原理,免疫过氧化酶染色技术的 基本原理,显色系统：三抗、酶、底物 联结系统：二抗 识别系统：一抗、组织抗原,识别系统,1、特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。特异性抗体具有识别并结合靶抗原的
7、功能，这是本技术的理论依据所在 2、特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求选用 3、特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有单抗又有多抗，可根据不同染色要求而选用 4、识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第一抗完成,显示系统,1、也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的，显示系统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见，从而确定抗原的存在及其定位 2、 显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在标记位点形成有色分子的终末产物，若显色剂为DAB，则出现棕褐色细颗粒沉淀E(酶)+S(底物) ES(酶底物复合物) P(反应产物) + E(酶) E(酶)可循环使用,显示系统,辣根过氧化酶的免
8、疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 HRPH2O2 有色分子终末产物+ HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRPH2O2：酶底物复合物,显示系统,免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点在于显色系统的差异： 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 PAP法： 利用PAP复合物 ABC法： 利用AB复合物 LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性,联结系统,1、联结或桥联抗体（一般为第二抗体） 2、按免疫学要求将识别系统与显色系统联结成为统一体 3、应采用何种联结抗体决定于特异
9、性第一抗体是多克隆还是单克隆：若一抗是多克隆抗体，则二抗是羊或其它动物的抗兔血清；若一抗是单克隆抗体，则二抗常是兔抗鼠的血清 4、有的联结抗体既能联结多抗，亦能联结单抗,三、免疫组化染色方法的类别,免疫组化染色方法的类别,直接法 间接法 PAP法 ABC法 LSAB法 一步法（EPOS） 两步法（Envision）,直接法,将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，没有联结系统、未用桥抗体。 优点：特异性高、非特异染色轻。 缺点：敏感性低，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记,间接法,将标记物标记在桥联抗体上（即二抗、三抗） 一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体，其酶标抗体必须是针对兔 优点：敏感
10、性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配 缺点：特异性差,PAP法 过氧化酶-抗过氧化酶法,组成： 1、一抗是针对靶抗原的特异性抗体 2、二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结PAP复合物 3、三抗是以过氧化物酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产生的抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（PAP）,优点 PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高 PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色 可用于福尔马林固定的石蜡切片,ABC法 亲和素-生物素法,组成：一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲
11、和素+酶标生物素） 优点： 1、亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。 2、 能用于常规石蜡切片。,亲和素生物素复合物,1、亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合 2、亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性 3、AB复合物多用于ABC法的免疫组化中,LSAB（SP）法 标记的链霉亲和素-生物素法,特点：将HRP直接标记于链霉亲和素上 优点： 1、 更快速：空间结构
12、更小 2、更敏感：链霉亲和素的亲和性更强，更易于到达深部位点 3、非特异背景更少：链霉亲和素空间结构特殊，不易与高荷电的组织成分（胶原纤维、结缔组织）联结,酶标亲和素,在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感,一步法（EPOS）及两步（Envision）,特点：以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法） 优点： 1、操作简便，省时 2、提高了敏感性和特异性 3、减少了背景着色 4、避免内源性生物素的干扰,多聚物载体,
13、一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物,四、免疫组化染色结果的判 断及异常着色的原因分析及 其对策,免疫组化染色结果的判断,特异性着色具备特点 1、特定的定位：特定的组织、特定的细胞、特定的细胞内的部位 2、着色的不均一性：分布上的不均一、着色强度的不均一 3、颗粒性显色：DAB显色剂应为棕黄到棕褐色,CK染色，结肠腺癌细胞膜特异性着色,Kappa 胞浆着色,TdT染色
14、，胞核着色,PR 胞核着色,ER 胞核着色,免疫组化染色结果的判断,对照的设置 1、空白对照 2、阳性对照 3、吸收试验对照 4、替代对照 5、自身对照,异常着色（假阳性）原因及对策,异常着色原因：内源酶及内源性生物素、抗体本身原因、切片制作不当、冲洗不充分、DAB显色产生背景着色假阴性的原因：抗原的丢失、抗原的遮蔽、抗体试剂因素、操作不当,非特异性着色原因及对策,内源酶及内源生物素 1、灭活过氧化物酶-3%H2O2 2、灭活内源性生物素-蛋清封闭或更换不含生物素的染色系统 3、灭活碱性磷酸酶,异常着色原因及对策,抗原自身原因 1、抗体不纯-应用单克隆抗体 2、标本中含有与靶抗原相似的抗原决定
15、簇-采用具更特异性抗原决定簇的单克隆抗体,异常着色原因及对策,切片制作不当 1、 严重变性坏死及炎性病灶处 2、 切片裱贴不平 3、褶皱处 4、组织边缘部,异常着色原因及对策,1、清洗不充分用含盐的缓冲液充分冲洗，可利于减低背景着色2、DAB显色产生背景着色未除去DAB的不溶性颗粒、DAB保存不妥，其氧化产物沉淀在组织上,非特异性背景着色原因及对策,电荷吸附加二抗动物非免疫血清（牛血清也常用）,假阴性的原因分析及对策,抗原的丢失标本固定不及时、固定过久，浸蜡时间、温度过高，均可将抗原性破坏 抗原的遮蔽 1、福尔马林固定石蜡包埋后，其抗原性因分子交联而被遮蔽 2、修复抗原，包括蛋白酶消化、微波加
16、热处理,抗体的因素 1、有效性：一抗的特异性、效价、保存时间、保存条件及有无菌类污染 2、抗体间的相互匹配：二抗与一抗、三抗与二抗不匹配，三抗必须是一抗同种动物来源的同型抗体,操作不当 1、掉片 2、消化了不该消化的靶抗原 3、切片放置不平抗体流失 4、遗漏重要的操作步骤（如漏加HRP的底物） 5、显色时间过短解决方法：严格按照操作步骤进行,五、临床意义,近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。,免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面： (1)恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断； (2)确定转移性恶性肿瘤的原发部位； (3)对某类肿瘤进行进一步的病理分型；,(4)软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的； (5)发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。 (6)为临床提供治疗方案的选择。,
