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1、临床微生物学导论,微生物与感染,感染性疾病的基本概念,感染infection 内源性 外源性 毒力virulence 半数致死量median lethal dose,LD50 半数感染量median infective dose,ID50 机体状况,微生物 机体毒力 免疫力侵入数量侵入门户,感染性疾病的基本概念,感染性疾病的类型 不感染 隐性感染covert infection 显性感染overt infection 持续性感染persistent infection 慢性感染chronic infection 潜伏感染latent infection 慢发病毒感染slow virus inf
2、ection 病原携带状态carrier state,微生物的致病性,致病性微生物 病原微生物primary pathogens 条件致病性微生物opportunistic pathogens 毒力 侵袭力invasiveness 粘附、定植和侵袭性物质 毒素toxin,粘附与定植,粘附adherence 粘附素adhesin G-菌与菌毛有关 G+菌与adhesin有关形成生物膜biofilm 受体receptors 定植colonization 粘附、定植和繁殖模式,毒素及毒性蛋白和酶,外毒素 内毒素 毒性蛋白和酶 溶血素 透明质酸酶 血浆凝固酶,细胞内寄生微生物的致病作用,细胞内寄生菌
3、结核分支杆菌、伤寒沙门菌 专性细胞内寄生的立克次体与衣原体 分子水平寄生的病毒感染,免疫病理损害,自身免疫应答与自身免疫病 风湿热、肾小球肾炎 幽门螺杆菌 金黄色葡萄球菌毒性休克综合征毒素为超抗原 免疫复合物损伤 乙型肝炎关节炎、肾小球肾炎 迟发型超敏反应 结核病,感染的临床征象 病症与症状,病程发展阶段 潜伏期incubation period 前驱期prodromal period 症状明显期period of apparent manifestation 恢复期convalescent period 疾病复发与再燃,常见症状与体征,发热 特点 热型 弛张热 稽留热 间歇热 微热 马鞍热
4、腹痛与腹泻 皮疹 毒血症状,临床微生物学导论,细菌感染的实验诊断,细菌感染的实验诊断要求,确定病原菌 病原菌、条件致病菌、正常菌群、耐药菌 将病原菌鉴定到种 标本直接药敏试验、分离后单种细菌的药敏试验 将病原菌鉴定到型（血清型、基因型）用于流行病学研究,诊断实验的选择原则,选择有鉴定价值的试验 形态、生化、毒力、基因 选择简易、快速、方便的试验 敏感性和特异性,常用诊断流程,双歧索引 表解法 数字编码鉴定法,双歧索引,革兰阴性杆菌,+,氧化酶,非发酵菌,弧菌科,肠杆菌科,葡萄糖发酵,+,双歧索引的优缺点,使用方便，常用的方法 主要针对相互区别比较容易，有较特殊特征的细菌 对相互区别较难的、鉴定
5、项目较多的细菌，双歧索引很烦琐、不方便,表解法,试验 埃希菌属 沙门菌属 克雷伯菌属 变形杆菌属靛基质 + -/+ -/ + +/- 枸橼酸盐 - +/- + +/- 硫化氢 - +/- - -/+ 葡萄糖酸盐- - + - 苯丙氨酸 - - - +用于相互区别比较复杂的细菌,临床标本的采集与处理,标本采集的一般原则 早期 无菌 不同细菌不同方法 适量标本 安全,标本的运送和处理,运送要求 最好在2小时内送到实验室 脑脊液等应在25运送 安全要求 密封容器，不能颠倒。专人运送 保存要求,细菌分离鉴定的基本流程,直接标本检查 接种不同培养基，在不同条件下培养 辨识可疑病原菌，进行菌种鉴定 形态学
6、、生理生化学、抗原、血清学、基因、动物实验，细菌变异 进行药敏试验 耐药性变异 报告,真菌感染的实验诊断,真菌的基本特性 临产标本的采集 真菌的检验,真菌的基本特性,真菌的概念 形态特性 单细胞 酵母菌和类酵母菌 多细胞 菌丝(hypha) 孢子(spore),真菌的基本特性,菌落特性 培养基：沙氏培养基(Sabouraud) 酵母型菌落 类酵母菌落 霉菌型菌落,临床标本的采集,标本种类 皮肤的角质性物质 各种分泌物和排泄物 血液和体液 脓液及渗出物 注意事项,真菌检验,标本直接检查形态学、免疫学 分离培养 沙氏培养基、抑菌剂、选择培养基 平皿培养、大试管、玻片培养（小培养） 生化反应 糖类发
7、酵试验 同化试验 碳源 氮源 动物实验、核酸检测、毒素检测,病毒感染的实验诊断,一般原则 标本采集与运送 病毒的分离与鉴定 病毒感染的快速诊断 病毒检验结果的评价,病毒感染的实验诊断 一般原则,特异、敏感、快速和简便 确定试验诊断方法 结合流行病学和临床特点 结合可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，及当前患者所处的时机 考虑多种病毒感染,试验诊断方法的选择,潜伏期短的病毒感染如呼吸道病毒 抗体尚无产生，测定抗体主要用于流行病学调查，人群易感性、疫苗接种效果测定 应测定病毒颗粒、病毒抗原或病毒核酸 潜伏期超过十天的病毒感染 特异性IgM，可以早期诊断；区别初次和再次感染,试验诊断方法的
8、选择,持续感染或潜伏感染 急性期和恢复期双份血清，抗体有无4倍以上升高 测定病毒核酸 原因不明 病毒分离 采集双份血清确认 测定多种病毒的病毒颗粒、抗原或抗体,标本采集,标本的采集 采样时间 标本的种类 根据临床症状、流行病学资料、病毒感染的特点 常见标本的采集方法,标本的运送,冷藏 4 短期保存数小时 -70 较长时间保存 -20 容易灭活 甘油或二甲亚砜作保护剂，防止反复冻融 运送液Virus transport media,VTM Eagles 或Hanks平衡盐溶液 添加 小牛血清或小牛血清白蛋白 青霉素100U/ml,链霉素100g/ml 二性霉素B2.5 g/ml或制霉菌素40 g
9、/ml,病毒的分离与鉴定的一般程序,病毒的分离,组织培养 原代和次代细胞培养 二倍体细胞株 传代细胞系 鸡胚接种 动物接种,病毒的鉴定,根据临床特点，流行病学资料，标本来源，可大致了解病毒的一些特性，有助于确认病毒的种类 动物感染范围及特点 细胞培养特点 血凝试验及血凝抑制试验 病毒的大小及形态 核酸类型鉴别及序列测定 耐酸试验 免疫荧光抗体染色 乙醚敏感试验,细胞培养特点,细胞变化 中和试验 空斑或蚀斑（Plaque）形成试验 干扰现象 红细胞吸附及吸附抑制试验,（1）细胞变化,细胞病变效应（Cytopathic effect ,CPE） 细胞溶解，细胞培养瓶中出现空斑 如肠道病毒 细胞融合
10、形成多核巨细胞 如疱疹病毒 细胞肿大，变圆堆积成葡萄状 如腺病毒，或胞质中出现空泡如SV40病毒 胞浆内或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体 如狂犬病病毒，巨细胞病毒等 不出现细胞病变现象 细胞培养液pH的变化 由于细胞代谢产酸导致培养液pH指示剂呈黄色 病毒的增殖抑制了细胞代谢，使培养液颜色不变或变红 但腺病毒不抑制细胞代谢，反而促进糖酵解增加产酸,（2）中和试验,是将病毒与特异性抗体进行免疫反应，使病毒失去感染性，在细胞培养和活的机体内不出现病变的试验 常用细胞培养进行中和试验 如果特异性抗体能中和病毒，使之失去感染性，不出现细胞病变效应，则该病毒为特异性抗体的同型病毒，用于病毒的分型诊断最具敏
11、感和准确性 可用于检查患者病后或人工免疫后，机体病变效应的病毒，需增加指示系统才能应用,（3）空斑或蚀斑（Plaque）形成试验,空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。 一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起的。 不同的病毒引起的空斑形态和大小不同。 可进行病毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可进行病毒的鉴定。,（4）干扰现象,某些病毒间存在着干扰现象，如某些型别的鼻病毒能干扰以后进入的副流感型病毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞吸附作用,（5）红细胞吸附及吸附抑制试验,受某些病毒（正粘病毒，副粘病毒）感染的宿主细胞，病毒增殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有
12、病毒某些抗原成分（血凝素），能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。可作为初步鉴定 如果在培养瓶中加入相应的血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现象，是为红细胞吸附抑制试验阳性，可作为病毒鉴定的依据,4血凝试验及血凝抑制试验,某些病毒可与一定种类的哺乳动物或禽类动物产生血凝现象 加入相应的血凝素抗体可抑制血凝现象的发生，是为血凝抑制试验。作为病毒型别确定的依据,5. 病毒的大小及形态,可用电子显微镜观察病毒的大小及形态,6. 核酸类型鉴别及序列测定,利用5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）抑制DNA复制的特性，在细胞培养液中加入BUDR，可抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细胞病变的出现。 对肠道RNA病毒无抑制作用
13、 亦可对病毒核酸特异序列或全序列的碱基排列测定或DNA杂交、DNA-RNA杂交来鉴定病毒,7. 耐酸试验,肠道病毒对酸有耐受力 而鼻病毒在酸性环境下易被灭活,8.乙醚敏感试验,病毒外围如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞 可作为病毒是否具有类脂包膜的依据 也可用氯仿或去氧胆酸钠代替乙醚进行试验。,9. 免疫荧光抗体染色,将感染细胞固定，用特异抗血清荧光标记染色，在荧光显微镜下，可见细胞内荧光，即可确定型别,病毒感染的快速诊断,一、形态学检查 光学显微镜 电子显微镜检查 二、病毒抗原检查 免疫荧光技术 酶免疫技术 其他技术 三、病毒感染后抗体检测 四、病毒核酸检测 斑点杂交法
14、 固相杂交技术 原位分子杂交技术 Southern 印迹和Nothern 印迹法 聚合酶链反应（PCR） 病毒核酸的直接检测,1、光学显微镜,可以观察到大型的病毒如痘病毒类。 可以观察到病毒感染的宿主细胞的胞浆内或细胞核内出现嗜酸性或嗜碱性的包涵体（inclusion body） 根据包涵体的特点，可以作出辅助诊断。 如狂犬病病毒感染后在脑细胞的胞浆中出现嗜酸性的圆形或椭圆形包涵体，称为内基小体（Nigri body） 巨细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出现周围绕有一轮晕的似“猫头鹰眼”样大型嗜酸性包涵体,包涵体,可能是病毒增殖的场所或病毒颗粒的聚合体 可能是宿主细胞对病毒作用的反应产物 大致上产
15、生核内包涵体的是在细胞核内装配的病毒（通常为DNA病毒），产生胞质包涵体的是在胞浆中装配病毒（通常为RNA病毒） 有许多理化因素和某些细菌也能导致细胞产生类似包涵体的变化,2、电子显微镜检查,(1) 电镜直接检查 某些病毒感染的早期在临床标本中就可出现病毒颗粒。经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。 如“秋季泻”患儿粪便中的轮状病毒 甲型肝炎患者粪便中的甲型肝炎病毒 痘病毒和疱疹病毒引起的疱疹的水疱液 乙型肝炎患者的血清中,(2) 免疫电镜检查,在含病毒的标本中，加入特异抗体。经抗原抗体反应后，使标本中的病毒颗粒聚集成块，再经负染观察，比直接电镜检查更易发现病毒体，灵敏度可提高100倍,二、病毒抗原检查,免疫荧光技术 适合于 病毒型别少，细胞培养难以成功的病毒如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等 肝活检组织中的肝炎病毒 神经组织中的单纯疱疹病毒 脑组织中的狂犬病毒或其它脱落细胞和活检组织中的病毒抗原检测 有直接和间接荧光法 间接荧光技术具有放大作用，灵敏度比直接法高。 易出现非特异性荧光，导致假阳性。需要严格对照和排除试验。 该技术也可用于病毒分离培养后的病毒鉴定工作和研究抗原在细胞内的位置及研究病毒在细胞内的复制过程。,
