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1、I摘 要丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge） ，为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，其根和根茎皆可入药，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效。近年来随着丹参需求的日益扩大，野生资源的逐渐减少，人工种植品种退化及病虫灾害等一系列问题的产生，导致丹参产量和质量的逐年降低。因此，有效提高丹参中活性成分的含量、培育优质新品种已成为丹参现代化开发利用的必由之路。丹参中主要次生代谢产物分为两大类：一类为水溶性的酚酸类化合物；另一类为脂溶性的丹参酮类物质。基于传统中药多以水煎服的用药方式，水溶性的酚酸类成分被认为是丹参发挥药效的活性物质。研究报道丹参中主要的酚酸类活性成分生物主要源于
2、酪氨酸代谢途径和苯丙烷类代谢途径，多为咖啡酸的衍生物，并且其合成受到一些 MYB 和 BHLH 类转录因子的调控。鉴于此，本论文在已有研究的基础上，选取丹参-基因为研究对象，克隆其启动子序列并进行序列的生物信息学分析，探究其潜在的表达调控模式，为更好地研究丹参-基因的功能及在丹参酚酸类合成中的作用奠定基础。1.利用 PCR 的方法从丹参 gDNA 水平克隆得到了-基因的启动子序列，该序列全长-bp。2.利用启动子在线分析软件进行启动子顺式作用元件分析。分析结果显示，该基因启动子区域上分布有与生物或非生物胁迫相关的顺式作用元件如-、-、-等，以及与激素响应相关的顺式作用元件-、-等。关键词：丹参
3、，-基因,启动子，顺式作用元件。Abstract第 1 章 引言1第 1 章 引言1.1 丹参的研究概况丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge） ，又名赤参、逐乌、郁蝉草、奔马草等，为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，产河北，山西，陕西，山东，河南，浙江，江苏，安徽，江西及湖南等地，生于海拔 1201300 米的山坡、林下草丛或溪谷旁1。根和根茎可入药，味苦，微寒。归心，肝经。具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦的功效。在临床上广泛用于用于月经不调，经闭痛经，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠，肝脾肿大，心绞痛等症的治疗2。丹参具有种植条件简单、繁殖周期短、即能杂交授粉又能自
4、交授粉3、次生代谢产物丰富，主要化学成分明晰4,5,6，基因组相对小7、基因操作技术成熟简便8-10等优点。是研究药用植物次生代谢产物生物合成及调控的理想材料。因此具有“药用模式植物”之称11-13。丹参为我国十大大宗药材之首，年需求量超万吨，仅原药材生产销售额达数亿元人民币，现已上市的中成药和复方制剂达百余种，总产值超过 100 亿元11。1.1.1 丹参主要化学成分及其药理作用对丹参活性成分的研究始于二十世纪三十年代。依据已分离化合物的特特够特征和理化性质，将其分为两类：脂溶性丹参酮类化合物与水溶性酚酸类化合物4,5,6。 （见图 1-1） 。自 1934 开始，现已分离鉴定的丹参脂溶性化
5、合物达 40 余种，主要包括丹参酮 I、IIA、IIB 、V 、VI，异丹参酮 I、II 、IIB，隐丹参酮，异隐丹参酮，丹参新醌 A、B、C 、D，二氢异丹参酮、丹参酮二酚、丹参环庚三烯酚酮等14。其中，丹参酮A 是丹参治疗冠心病的主要成分之一，具有扩张冠状动脉、 、抗血小板凝集、清除氧自由基、改善记忆力障碍等作用，被 2010 年版中华人民共和国药典规定为丹参药材质量控制的指标成分之一；隐丹参酮具有强抗菌性，而且对治疗心肌缺血也有一定的疗效并对治疗心肌缺血也有一定的疗效，是丹参抗菌消炎类制剂的质量控制指标2,15-17。对丹参水溶性成分的相关研究始于 20 世纪 70 年代，至今已分离鉴定
6、了咖啡酸、迷迭香酸，迷迭香酸甲酯，丹酚酸 A、B、C 、D、E、F 、G， 原儿茶醛，原儿茶酸，紫草酸，丹参素，异陕西师范大学硕士学位论文阿魏酸，紫草酸单甲酯，紫草酸二甲酯， 紫草酸乙酯等 20 多种水溶性的酚酸类物质4,18-19（图 1-1） 。丹参水溶性酚酸类成分主要表现为抗氧化作用20。丹酚酸B 是目前发现的抗氧化作用最强的天然产物之一，也是丹参中含量最高的酚酸类化合物，对心、脑、肝、肾、胃等多个器官具有保护作用，被 2010 年版中华人民共和国药典规定为丹参药材质量控制的水溶性指标性成分之一；迷迭香酸具有抗炎镇痛作用；丹参素和原儿茶醛是治疗冠心病的有效成分2,20-23。鉴于传统 y
7、ij 中药以水煎服的用药方式，丹参水溶性化合物受到人们越来越多的关注。除以上所述化合物，丹参中还含有微量的鼠尾草酚、弥罗松酚、黄芩苷、熊果酸、柳杉酚、琥珀酸和 -谷甾醇-D-葡萄糖苷等化学成分。图 1-1 丹参酚酸类化合物的结构Figure 1-1 Structures of the phenolic acids of S. miltiorrhiza1.1.2 丹参资源利用的现状随着对丹参有效成分及药理作用的深入研究，近年来以丹参为主要原材料的产品不断被推出，丹参的需求量越来越多。伴随着丹参需求量的日益增加，对丹参野生资源的采挖力度加大，同时人工种植面积也在不断增加。但是，丹参作为异交植物，其
8、种内变异非常大，性状也很复杂。因此只注重扩大栽培面积而忽略其优良品种选育导致了丹参品种严重退化，质量不均一，有效成分含量降低等诸多问题，从而影响了丹参作为高品质药用植物大规模进军国际市场24-25。另外，人工栽培条件下药田生态环境中生物多样性差、丰富度低，导致丹参病虫害优势种群突出、病虫害频发等问题也严重影响了药材的产量和质量26,27。因此为了提Comment A1: 第 1 章 引言3高丹参品质，更好的满足其市场需求，近年来利用基因工程、细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良来筛选优异丹参资源细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良，筛选优异丹参资源，提高丹参药材有效成分的含量愈来愈受到
9、人们的重视。1.2 丹参酚酸类物质的合成1. 2.1 丹参酚酸类成分生物合成途径的研究概况 迷迭香酸在多种唇形科植物中均有发现，迷迭香酸生物合成相关酶基因已经研究的较为清楚。咖啡酸和丹参素等几种单苯环物质可由氨基酸直接氧化脱氨生成，而其余均可视为咖啡酸与丹参素酯化缩合反应得到产物。丹参素源于酪氨酸代谢途径，咖啡酸来自苯丙烷类代谢途径，迷迭香酸是由酪氨酸代谢途径和苯丙烷类代谢途径共同参合成的。酪氨酸代谢途径中的羟基苯丙酮酸还原酶（HPPR）与酪氨酸氨基转移酶（TAT）参与了丹参素的合成；迷迭香酸合酶（RAS） 、苯丙烷类代谢途径中的苯丙氨酸解氨酶（PAL） 、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和 4-
10、香豆素辅酶 A 连接酶（4CL）以及酪氨酸代谢途径中的 TAT 和HPPR 共同参与了迷迭香酸及丹酚酸 B 的生物合成过程28-29。丹参酚酸类化合物的生物合成途径分为三部分。第一部分：莽草酸途径，由葡萄糖经过多步酶促反应生成莽草酸，进而形成芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸，它们是连接初生代谢和次生代谢的关键。第二部分：酪氨酸代谢和苯丙烷主干代谢两条互相平行的途径，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL）催化作用下生成肉桂酸，肉桂酸在细胞色素 P450 单加氧酶 CYP73 亚家族的肉桂酸- 4- 羟化酶(C4H）和 4- 香豆素辅酶 A连接酶(4CL)的催化下生成 4- 香豆酰 CoA ，是植物酚酸、
11、黄酮类和木质素类物质合成的通用途径；酪氨酸经由酪氨酸氨基转移酶（TAT ）和羟苯基丙酮酸还原酶（HPPR）的催化合成丹参素。第三部分：丹参酚酸类物质的特异合成途径，以 4- 香豆酰辅酶 A 和 4- 羟苯基乳酸为前体通过迷迭香酸合酶（RAS ）催化苯丙烷类代谢途径来源的 4- 香豆酸 CoA 和酪氨酸途径来源的 4- 羟苯基乳酸缩合、羟化形成迷迭香酸，迷迭香酸再经多步缩合、还原反应合成丹酚酸 B28-29。1.2.2 丹参酚酸类物质的调控研究目前对于丹参酚酸类活性成分生物合成的骨架途径已研究的较为清楚。丹参酚酸类活性成分生物合成主体途径上的多数酶基因已被克隆，这些酶基因的表达陕西师范大学硕士学
12、位论文及调控与酚酸类化合物的累积密切相关。丹参中苯丙氨酸解氨酶（PAL） 、肉桂酸-4-羟化酶（C4H） 、4-香豆素辅酶 A 连接酶（4CL） 、酪氨酸氨基转移酶（TAT） 、羟苯基丙酮酸还原酶（HPPR）以及迷迭香酸合酶（RAS）共同参与了酚酸类化合物主要成分-丹酚酸 B 的生物合成过程30。1.3 各自基因的介绍1.3.1 -基因概述重点阐述！1.3.2 -基因启动子的研究进展重点阐述！1.3.2 -基因的表达调控图 1-2 植物酚酸类物质的合成途径 Figure 1-2synthetic route of plant pheonlic substanve. 第 1 章 引言5重点阐述！
13、1.4 本研究的目的意义 缩略词表英文缩写英文名称中文名称 -第 3 章 丹参 SmPAP1 基因的生物信息学分析21第 2 章 丹参-基因启动子序列的克隆2.1 实验材料、试剂及主要实验仪器2.1.1 实验所用植物材料丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）种子从购自陕西道地药材有限公司，种于蛭石与营养土(体积比约为 3：1)混合的培养土的盛有蛭石的培养盆中于人工气候箱中培养，每隔两天浇一次水。当幼苗长出第二对真叶时栽至含蛭石的营养钵中，每个营养钵种 3 棵幼苗。人工气候箱培养条件：光周期 16/8 h（day/night） ，光照强度 2000 lx 216 molm2s
14、-1，温度 25 2 ，湿度 60 80 %。本章实验材料为人工气候箱中培养 30 d 后的丹参实生苗。将丹参种子种在蛭石与营养土(体积比约为 3：1)混合的培养土中，幼苗在第二对真叶长出时移至营养钵中培养，培养条件：温度 25 2 C，湿度 60 80 %，光周期 16/ 8 h（day/night） ，光照强度 2000 lx。2.1.2 实验试剂LA EX Taq Polymerase、dNTP mix,T4 DNA Ligase,PrimeScript RT reagent Kit EmeraldAmp PCR Master Mix, DL 2000 DNA Marker, pMD19
15、-T Simple Vector（购自TaKaRa公司）；BD Genome Walker Universal Kit（购自Clontech公司）；DNA胶回收试剂盒（AXYGEN公司）；氨苄青霉素 钠（Ampicillin sodium，Amp）Amresco 公司引物序列合成，克隆片段测序均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成；其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。附：实验所用缓冲液和培养基配方，及本章实验中所用到但未列出的各种试剂配制方法参考分子克隆实验指南104。（1）实验所用抗生素及植物激素的配制：Amp储备液（100 mg/mL）：无菌水溶解10.0 g氨苄青霉素钠 ，定容至100
16、mL，0.22 m无菌滤头过滤除菌，1 mL分装置于-20 贮存。以100 g/mL的使用陕西师范大学硕士学位论文终浓度添加于LB培养基；（2） CTAB提取液(1L)CTAB 10.0g； PVP 25.0g；NaCl 40.908g；EDTA 3.7224g；Tris: 6.057g；调PH8.0。（3） TAE缓冲液（50）（使用的时侯稀释至1）：Tris 242.0 g；EDTA 18.612g；冰乙酸 57.1 mL；加H2O定容至1000 mL，室温保存。（4） LB (Luria-Bertani) 培养基（1 L）：NaCl 10.0g；Tryptone 10.0g；Yeast
