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1、齐 齐 哈 尔 大 学毕业设计（论文）题 目 靶向 MRP1 基因 pRNAT-H1.1shuttle-RFP 重组质粒表达载体构建学 院 专业班级 学生姓名 指导教师 成 绩 2011 年 6 月 20 日摘摘 要要癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白 1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1）的
2、过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。RNA 干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过 RNAi 技术沉默 MDR1 基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。目的：本课题选用 pRNAT-H1.1shuttle-RFP 表达穿梭载体。构建针对 mrp1 mRNA的 RNA 干扰表达载体。方法：将预先根据 MRP1 基因序列设计合成的编码 siRNA 的 cDNA 序列与pRNAT-H1.1shuttle-RFP 质粒载体连接，构建靶向 mrp1 siRNA 重组质粒。将重组质粒转化 E.
3、coli DH5 后大量提取重组质粒，经菌落 PCR 和 DNA 测序分析检测重组载体构建结果。结果：成功构建靶向 MRP1 基因 pRNAT-H1.1shuttle-RFP 重组质粒表达载体。为下一步抑制 mrp1 基因在肿瘤细胞中的表达奠定基础。关键词：RNA 干扰；MRP1；pRNAT-H1.1shuttle-RFP 质粒；穿梭载体 AbstractCancer, a serious threat to the rising trend. Chemotherapy as the routine clinical therapy of tumor, which is an irreplac
4、eable way in cancer treatment. MDR of tumor cell cause the failure of chemotherapy treatment . The reason causing the cancer MDR is relatively complicated, and the excessively expression of multidrug resistance-associated protein 1(MRP1) is one of the reasons causing MDR. Silencing MDR1 gene by RNAi
5、, we can improve the effect of chemotherapy by decrease the level of MDR. Objective: In this study, pRNAT-H1.1shuttle-RFP plasmid was selected to construct the RNAi expression vector of mrp1 mRNA. Methods: According to mrp1 we designed and synthesized the DNA fragment that was cloned into pRNAT-H1.1
6、shuttle-RFP vector to construct recombinant vector. Transformed the recombinant vector into E.coli DH5. The result of recombinant vector was analyzed and identified using PCR and DNA sequencing . Results: Constructing pRNAT-H1.1shuttle-RFP recombinant plasmid expression vector was constructed succes
7、sfully. It may be the foundation of restrain the expression of MRP1 gene in cancer cells.Key Words：RNA interference；MRP1；pRNAT-H1.1shuttle-RFP plasmid；shuttle vector目 录摘 要 IAbstract .II第 1 章 绪 论 11.1 RNAi 的研究进展 1 1.1.1 RNAi 的发现过程.1 1.1.2 RNAi 的分子作用机制.2 1.1.3 RNAi 的特点.3 1.1.4 siRNA 简介3 1.1.5 siRNA 的设
8、计原则3 1.1.6 RNAi 在抗肿瘤方面的研究.4 1.2 用于 RNAi 的载体 .4 1.2.1 载体的选择5 1.2.2 质粒人工构建的目的 .5 1.3 MRP1 的研究进展5 1.3.1 MRP 的转运底物、组织分布及生理作用6 1.3.2 MRP 在组织中的表达6 1.4 基因治疗 .71.5 本课题在国内外的研究现状 .71.6 本论文的研究目的及意义 .81.7 本论文的主要内容 .8第 2 章 实验材料与方法 .92.1 实验材料 .9 2.1.1 宿主菌 .9 2.1.2 质粒载体 .9 2.1.3 载体通用引物 11 2.1.4 主要试剂及工具酶 11 2.1.5 主
9、要仪器 12 2.2 实验方法 13 2.2.1 shRNA 的设计与退火.13 2.2.2 合成干涉片段的退火 16 2.2.3 重组载体的构建 17 2.2.4 菌落 PCR 初步筛选阳性重组子.20 2.2.5 测序鉴定重组载体 21 2.2.6 重组质粒大提的 OD 值检测 .21第 3 章 结果与分析 223.1 质粒经 Hind和 BamHI 双酶切后胶回收结果.22 3.1.1 质粒经 Hind和 BamHI 双酶切后结果22 3.1.2 目的片段的回收 23 3.2 重组载体的菌落 PCR243.3 重组质粒大量提取 253.4 重组质粒测序结果 26讨 论 294.1 菌落
10、PCR 鉴定重组 .294.2 重组质粒穿梭载体的构建 29结 论 30参考文献 .31致 谢 .34第第 1 章章 绪绪 论论1.1 RNAi 的研究进展RNA 干扰(RNA interference , RNAi)是由双链 RNA 分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为一种双链 RNA 分子在 mRNA 水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。RNAi 有望成为分析人类基因组功能的有力工具，在肿瘤病因、免疫机制及治疗等方面的研究上有广阔的发展前景。1.1.1 RNAi 的发现过程1990 年，Rich Jorgensan 和他的同事在对矮牵牛花进行实验时，无意中发现一种
11、奇怪的现象。他们尝试把 pigment-produing 这种由强有力的启动子控制的基因导入矮牵牛花以加深花的紫色，结果却发现不但颜色未加深，许多花呈现杂色甚至白色。Rich Jorgensan 把这种现象称为共同抑制，因为导入了外源性基因，使得和内源性基因具有相似功能的基因的表达都被抑制了1。遗憾的是当时这种现象并未引起 Jorgensen 的重视。1994 年，Cogoni2和 Macino 采用粗糙脉胞霉进行转基因研究时，发现真菌中也存在类似的现象，他们称之为基因抑制，这一现象后来在其它真菌中也相继被发现。1995 年 Guo3 等在对线虫的实验中发现，正义 RNA 与反义 RNA 一样
12、可以阻断par21 基因的表达，可惜作者同样对这一现象也没有更深入的研究，只做了普通的报道。直到 1998 年，关于 RNAi 现象的研究才被人们真正的发现4。Fire5等将双链 RNA，即正义链和反义链的混合物，注射到线虫的体内，却诱发了比正义链或反义链的单独注射效果更强的基因沉默，要彻底使同源基因的表达沉默，在每一个细胞中，只需要很少的几个分子的双链就可以做到。在接下来进行的实验中还证实6，将双链RNA 注入线虫体内后 ，不但阻断了线虫体内所有同源基因的表达，同时还沉默了其第 1 代子代的同源基因，他们从此把这种现象命名为 RNAi。随后，RNAi 现象又陆续在果蝇、锥形虫、真菌、涡虫、植
13、物及斑马鱼等真核生物的研究中被发现7。这种情况揭示了 RNAi 现象可能出现于生命进化的早期阶段，在 RNAi 机制发现之前，不同生物中的 RNAi 现象有着不同的描述：真菌中称为“镇压”作用，在植物中被称为转录后基因沉默和基因协同抑制 8。1.1.2 RNAi 的分子作用机制RNAi 的作用机制在众多学者的努力研究下日渐明朗。不同生物体内的 RNA 干扰作用机制也各有不同，但是主要可以分为两种类型：特异效应作用机制与非特异效应作用机制。特异性效应一般发生在短双链 RNA（2123nt）上，非特异性效应发生于长双链 RNA（30nt 以上） 。9。其中，RNAi 的特异效应作用机制是在多个不同
14、的水平上实现的，包括翻译水平、转录水平、转录后水平等。其中，转录后水平 RNA 干扰的研究最为深入，应用也最为广泛。101.1.2.1 特异性效应转录后水平的 RNA 干扰的发生机制是在对果蝇、线虫等生物体进行科学研究从而进一步推导得出来的。随着科学技术的发展和 RNAi 研究的深入，人们对 RNAi 的作用机制的了解也越来越多，通过生化和遗传学研究，现在普遍认为 RNAi 可能的作用机制主要包括两个阶段：第一步：起始阶段，即内源或外源 dsRNA 经特定的 RNase III 家族的双链特异的核糖核酸酶(Dicer) 以 ATP 依赖的方式将长的 dsRNA 切割成2123 nt 的小干扰
15、RNA；第二步，效应阶段，即 siRNA 与 RNA 诱导沉默复合物RISC 结合共同降解靶 mRNA11。除此之外还有某些研究认为 RNAi 的作用机制还存在着第三阶段循环放大阶段。这是 RNAi 的自身循环放大机制，其机制主要是指在效应阶段，RISC 活化后与 mRNA 结合，mRNA 被内切核酸酶切割成大小在 l223nt不等的小片段，这些片段可以特异性地阻碍表达靶基因。同时，释放出来一种可以作为特殊引物的 siRNA，从而以靶 mRNA 为模板在 RdRP 的作用下，合成新的 dsRNA。这种 dsRNA 可以降解成新的 siRNA，在这个循环中表现出放大效应 10。抑制相应 mRNA 的翻译可阻碍相应的蛋白质表达，这就是翻译水平的 RNA 干扰机制12，其中 stRNA 起到了非常的重要作用。转录水平上的 RNA 机制是通过 siRNA 与互补的 DNA 直接发生作用，从而加强同源 DNA 的甲基化，以阻碍目的基因转录，使表达关闭，从而强化基因沉默。有文献谈到组蛋白 H3 及相应 DNA 区域可被 dsRNA 诱导甲基化。一旦启动子区域出现甲基化，那么转录将被阻断，如编码区出现甲基化，则可以进行转录，但在转录后水平上沉默。1.1.2.2 非特异效应研究表明，长度大于 30nt 的长双链 RNA 转染至哺乳动物体内，dsRNA 会激活双链
