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1、乙型肝炎病毒cccDNA 检测方法与应用价值,第二军医大学长征医院 缪晓辉 2005.10,一、几个相关问题简介,什么是HBV cccDNA?,即共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。,乙型肝炎病毒基因组结构示意图,乙型肝炎病毒的复制过程,我们为什么要关注HBV cccDNA?, cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池” 目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除ccc
2、DNA的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治疗后容易复发的原因之一 肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏 移植术后乙肝复发的来源 还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世,为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?,研究和开发该检测技术的时间不长 检测技术上的难度较大 前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏模，不能满足临床检验的需求 现有技术灵敏度不高，检测低限104 copy/ml左右 分研究机构和学者对检测技术的特异性认识不足，存在缺陷,多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA），必须有效地分离cccDNA和其他类
3、型的病毒DNA 如何进一步解决特异性的问题？ 如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA含量的较低），血清中含量？ 如何简化检测步骤？,建立cccDNA检测技术必须克服的难点,分离cccDNA和rcDNA的分子基础,分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异,二、HBV cccDNA检测技术,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,现有的几种cccDNA检测技术简介,选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者探针法（Invader as
4、saay） 3.嵌合引物荧光PCR法,设计一对特殊引物：跨双缺口引物 正义引物P1 ：与负链互补结合，位于正链缺口上游反义引物P2 ：与正链互补结合，位于负链缺口下游 目的：rcDNA不被扩增,1.选择性PCR,选择性PCR：rcDNA不被扩增,选择性PCR：cccDNA能被扩增,PCR产物自身退火（self annealing）,“选择性”PCR：并非万无一失,国内外许多研究者忽略了这个问题，rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC）World J Gastroenterol 2004;10(1)
5、:82-85(血清),Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copyHepatology 1996;23:405-413,我们的经验：血清HBV rcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性,“选择性”PCR：并非万无一失,与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,rcDNA不能被扩增 无荧光信号,EcoR I,5,+,P1,P2,3200(1),5,3,1590,3,1820,P1,1820,1590,+,3200（1）,EcoR I,P2,cccDNA能被
6、扩增 检测到荧光信号,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,实时荧光定量PCR的原理,实时荧光定量PCR的原理,实时荧光定量PCR的原理,标准曲线方程YCt= 42.0827-3.5554logXcopy相关指数： R2=0.995灵敏度至少可以达到103copy/ml,我们的结果 ：,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA非特异性扩增的问题 由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普通PCR更高,缺陷：,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,解决方案,特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA采
7、用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法酶切纯化cccDNA采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safe DNA酶,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,2.侵入者探针法(Invader assay),两个体系：两种特殊的探针：invader probe和primary probe，后者含与待测模板无关的5侧翼的碱基片段。荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶 (cleavase,裂解酶)特异地切割5侧翼碱基片段作为第二个invade
8、r，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号。 特点：一个模板可以重复使用，每“结合裂解结合裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大,侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点,优点：线性信号放大，特异性比荧光PCR法强缺点：灵敏度低：104copy/ml,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者分析法（Invader assaay） 嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,3. 嵌合引物荧光PCR法,Shao, et al. J Virol Methods 2003； 11
9、2：45-52,N：与HBVDNA非同源片段,rcDNA,cccDNA,3. 嵌合引物荧光PCR法,嵌合引物荧光PCR的优缺点,优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏度比侵入法提高缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的rcDNA被非特异性扩增,无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。,三、影响cccDNA池的因素,1.cccDNA池的自身恒定, cccDNA池：感染肝细胞核内HBV cccDNA的含量在无外来干扰的情况下保持恒定(550copy/cell) 病毒自身调节：关
10、于病毒的进化关于病毒的“思维”病毒自身的调节 外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果,2.抗病毒药物对cccDNA的影响,现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能清除cccDNA 细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性,抗病毒药物对cccDNA的影响,（文献举例）,阿德福韦治疗48周结果,Hepatology 2005;42:302-308,举例,3.肝外组织也是cccDNA的储存池？,肝外组织细胞中HBV标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺、PBMC等组织或细胞中均检测到HBV的
11、标志物 HBV吸附？暂居？建立感染状态？依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA，但必须解决检测技术问题,(1)有关PBMCs中cccDNA检测的研究,PBMCs中cccDNA检测结果不一的原因,方法学的问题: 假阳、阴性率？灵敏度？目前报道阳性结果者均采用套式PCR ！ 研究模型的选择？ 病毒因素？ 细胞数量的多少？ 其他：免疫功能状态、实验室条件等,(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题,(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题, “血清中rcDNA含量越高，cccDNA阳性率越高和含量越高”的现象，使我们对方法学提出质疑 肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放cccDNA入血 细胞坏死后，cccDNA释放入血是必然的，但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少时间？,四、今后需要研究的问题,加强HBV慢性感染者不同病情和病期肝组织和肝外组织中cccDNA水平研究 研究HBV cccDNA在血液中的降解时间对血清检测的意义 以肝移植患者为研究对象，探究肝外组织cccDNA池，并据此研究HBV慢性感染者肝外损害的机制等 能否通过血清中可能存在的cccDNA及其含量的动态观察，对HBV感染肝衰竭患者进行预后分析？ 能否把cccDNA检测作为研制新的抗病毒药物疗效的评价标准？ 生物疗法（包括基因疗法）是否应该“聚焦”核内cccDNA？,Thank you,
