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1、基质金属蛋白酶（MMPs)及其组织抑制物（TIMPs）概括与研究现状,硕士研究生 马飞,据临床统计,约有80 %以上的肿瘤患者死于肿瘤的侵袭与转移,肿瘤细胞侵袭与转移的成功在很大程度上正是依赖于各种酶降解了细胞外基质及基底膜（Extracellular matrix ECM）依据酶底物成分的理化、生物学特点将这些酶其分为：金属蛋白酶类、丝氨酸蛋白类、巯基蛋白酶类、酸性蛋白酶类等。,目前，金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases ,MMPs)被认为是这些酶中最重要的一种。 对金属蛋白酶类(MMPs) 及其组织抑制因子( Tissue inhibitors of metal
2、loproteinases , TIMPs) 的研究最多 1 。,1 Nelson AR ,Fingleton B ,Rothenberg ML ,et al. Matrix metal2loproteinase :biologic activity and clinical implicationJ . J ClinOncol ,2000 ,18(5) :113511491,基质金属蛋白酶(MMPs)最早在研究蝌蚪变态发育时发现，截止2003年至少发现28种【2、3】MMPs具有高度同源,其分子结构以高度依赖Zn离子特征。MMPs是目前发现的唯一能分解纤维类胶原蛋白的水解酶，因此在生理及病理
3、中有着广泛的研究,2. Gross J, Lapiere CM. Collagenolytic activity in amphibian tissues; a tissue culture assay. Proc Natl Acad Sci USA. 1962;48:1014-1022. 3。Yan L, Zucker S, Toole B. Role of the multifunctional glycoprotein, EMMPRIN (Basigin; CD147) in tumor progression. Thrombosis (in press).,Matrix metallo
4、proteinases ,MMPs,MMPs nomenclature class,Collagenases,Stromelysin,Other MMPs其他,Gelatinases,Minimal domain,MMP一7,MMP一1,MMP一3、10、11、12,mtMMp膜型基质金属蛋白酶,MMP一2、9,MMP一12、19、20、 28,MMP一14、15、23、24、17、25,基质溶解素,胶原酶,间充质溶解素,明胶酶,History and Domain Structure of MMPs. Compilation of MMPs. Date of discovery of MMP
5、 and amino acid sequence listed in parentheses 4,4 Holmbeck K, Bianco P, Caterina J, et al. MT1-MMP deficient mice develop dwarfism, osteopenia, arthritis, and connective tissue disease due to inadequate collagen turnover. Cell. 1999;99:81-92.,MMPs的结构具有高度的同源性,其肽链含有2个Zn离子，其暴露为MMPs 活化所必需;均含有一个半胱氨酸开关,可
6、封闭或暴露活性中心2价阳离子并维持酶蛋白的稳定; 肽链一般含三个结构域即N-末端前肽域、催化域和C-末端类血红素域,后两个域区较为保守。,MMPs结构：,Archetypal MMP Structure,明胶酶（Gelatinases)即IV型胶原酶(type IVcollagenase)，包括MMP一2（GelatinasesA），MMP一9 （GelatinasesB）型胶原酶可以特异性的降解细胞外基质中的型胶原成分，与肿瘤的侵袭和转移关系密切，是目前MMPs家族中研究的最广泛的一种。二者的区别在于前者非糖化，分子量为72kD;另外一种被糖化，分子量为92kD。,3 fibronectin
7、 type II modules (1-3) are intercallated into the catalytic domain proximal to the active site.,mtMMp 膜型基质金属蛋白酶MMP一14、15、23、24、 17、25特点为：含有一个跨膜区，可将蛋白酶固定到细胞膜表面,MMPs在正常的细胞(结缔组织细胞、内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、胸腺细胞等) 和多种肿瘤细胞中均有表达。 MMPs主要功能包括生理功能及病理作用 MMPs 的生理功能主要有:降解细胞外基质膜有效成分、调节细胞粘着直接或间接参与胚胎发育、组织模型再塑及创伤修复等正常生理过程。MMP
8、s的病理作用主要表现慢性疾病（慢性心脏衰竭 慢性柱塞性肺疾病、慢性炎症）、关节炎以及肿瘤发生、侵润及转移中。,Tissue inhibitors of MMPs (TIMPs),TIMPs是MMPs的组织抑制因子,两者表达水平的动态平衡关系决定了细胞外基质的降解程度 ，一般认为活化型MMP 与与之相对应的TIMP呈11 比例的结合将导致MMP 功能的抑制【5】。,5。Nelson AR ,Fingleton B ,Rothenberg ML ,et al. Matrix metal2loproteinase :biologic activity and clinical implication
9、J . J Clin Oncol ,2000 ,18(5) :113511491,自1983 年Welgus 首次报道TIMP 以来,迄今已发现四种: TIMP-1 , TIMP-2 , TIMP-3 , TIMP-4 。TIPMPs 广泛分布于组织及体液中,主要由巨噬细胞和结缔组织产生 关于TIMPs对MMPs抑制机制目前尚不完全清楚6TIMP-2 还在细胞生长、繁殖及刺激血管生成等生理和病理学方面发挥一定的作用。,5 Yoshiji H ,Gomez DE ,Thorgeirsson UP. Enhanced RNA ex2pression of tissue inhibitor of m
10、etalloproteinase21 ( TIMP21) in human breast cancerJ . Int J Cancer( Pred Oncol) ,1996 ,69 1311341,TIMP-2 Binding Sites,TIMP-2 Binding Progelatinase A Trimolecular Complex,MMPs与TIMPs在肿瘤侵袭中的研究,目前研究认为MMPs-TIMPs平衡是维持ECM内环境和完整性的决定因素。 在肿瘤的侵袭与转移中ECM破坏加剧是MMPs-TIMPs平衡失控的结果。,Schematic diagram of interaction
11、between cancer cells and stromal within a tumor with a focus on role of MMPs.,MMPs作用机理： （1）破坏局部组织结构，促进肿瘤生长。 （2）破坏基底膜屏障，利于肿瘤转移。 （3）通过对ECM的改进，促进肿瘤新血管的形成。目前国内对MMPs在乳腺癌、胆管癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等癌症中的表达及其与恶性程度、密切相关作用、预后的关系均有所研究，但缺乏统一标准。 MMPs与胰腺癌的关系国内研究较少，尚无较多报道。,MMPs 和TIMPs 的研究手段,目前的研究方法主要有:免疫组化法、酶联免疫法、印迹法(Nort
12、hern blot和Western blot) 、明胶酶显影法及放射性标记胶原基质降解分析等。 免疫组化法应用于器官组织定位分析;酶联免疫法应用于细胞培养液、组织器官匀浆液及各类体液的含量分析; Northern blot 应用于不同组织细胞MMPs 和TIMPs 的mRNA表达分析;Western blot 目前多用于明胶酶的定性分析; 明胶酶显影法特异地应用于明胶酶的分析,能同时定量酶的活性及定性酶的型别。,免疫组化法研究MMP-2及MMP-9在脑星型胶质细胞中的表达,半定量逆转录-聚合酶链反应（PT-PCR）方法检验MMP-2及MMP-9在结肠癌组织中的表达。8,8.鄢阳，郑军华、许云飞
13、等结肠癌组织中MMP-2、 MMP-9、VEGF和RECK基因的表达及临床意义J】第二军医大学学报，2007，28(10)：10751078,小结,MMPs 及TIMPs 与肿瘤侵袭转移的关系十分复杂,从理论上讲二者的动态平衡的改变是肿瘤侵袭转移成功的关键因素。 研究MMPs 及TIMPs 与肿瘤的侵袭转移这一领域研究的深入,将为临床肿瘤的诊断预防提供可信的指标,也为临床治疗肿瘤提供新的策略与方向。 MMPs 及TIMPs 在胰腺癌中的表达情况研究较少，可做进一步研究,开题报告,基质金属蛋白酶MMP-2 及MMP-9在胰腺癌中的表达研究,硕士研究生 马飞,一、立论依据,基质金属蛋白酶 (mat
14、rix metalloproteinases,MMPs) 基质金属蛋白酶是一个需要Zn+等金属离子作为辅助因子的大家族。各种MMP间具有一定的底物特异性。同一种MMP可降解多种细胞外基质及基底膜（ECM），一种细胞外基质成分又可被多种MMP降解，但不同酶的降解效率不同。MMPs几乎能降解ECM中的各种蛋白成分,肿瘤细胞破坏细胞组织学屏障在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，MMPs被认为是该过程中最重要的蛋白水解酶，从而成为近年来研究的热点。,目前MMPs家族已分离鉴别出28个成员，编号分别为MMP128。接基底物特异性主要分为六类： (1)胶原酶(collagenase)包括MMP-1，8，13。
15、(2)IV型胶原酶(type IVcollagenase)，即明胶酶，包括MMP一2，MMP一9 。 (3)基质溶解素(matrilysin)，包括MMP一726。 (4)膜型基质金属蛋白酶(MTMMp)，包括MMP-l4，15，16，17。 (5)间充质溶解素(stromelysin)，包括MMP-3，10，1112。 (6)其他MMP。,型胶原酶为MMPs家族中重要的一类，它主要有两种形式，一种非糖化，分子量为72kD，被称为MMP-2（明胶酶A）;另外一种被糖化，分子量为92kD，命名为MMP-9（明胶酶B）。 型胶原酶主要降解细胞外基质中的型胶原成分，与肿瘤的侵袭和转移关系密切，在肺癌
16、、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、皮肤，鳞状细胞癌等多种肿瘤细胞中均发现MMPs的表达的增高，在部分肿瘤中还发现随着肿瘤恶性程度的增高，MMPs的表达也增高，且与肿瘤的浸润和转移相关。其中对MMP-2的研究较多。,胰腺属于腹膜后位器官，位置隐蔽，胰腺癌起病隐匿，发展迅速、凶险，临床特点为病程短、进展快、死亡率高，多数患者诊断时已处于晚期（局部或远处转移），手术切除率15，病程不到1年，总5年生存率不足5。,MMP-2及MMP-9在其他肿瘤中表达的研究较多，但是MMPs在胰腺及胰腺癌中研究国内外研究较少，本实验应用免疫组织化学 等方法对其进行研究，初步探讨MMP-2和MMP-9在胰腺癌中的表达及意义两种酶的相关性、与癌癌发生、侵润、转移及预后的关系及其临床意义。,二、研究方案,收集2010年至2011年湘雅医院胰腺癌手术病人石蜡标本30例(术前均未经化疗,放疗,免疫治疗或其他抗肿瘤治疗)，术后均病理学确诊。分期采用国际抗癌协会UICC分期法TNM分期分组.另取正常胰腺组织和慢性胰腺炎切除石蜡标本若干作为对照。同时按照性别、年龄、组织学分型，肿瘤大小及转移情况分型。标本分别进行10%中性福尔马林溶液固定24h 低温石蜡包埋，HE染色并分组。,
