《临床检验免疫学 生物素亲和素免疫放大技术课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《临床检验免疫学 生物素亲和素免疫放大技术课件（79页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生物素-亲和素免疫放大技术,湘雅医学院医学检验系,Biotin-Avidin Immune Amplification Technique,掌握生物素-亲和素系统的特点,目的与要求：,熟悉生物素的理化性质与活化,了解生物素-亲和素系统的应用,概述: 生物素、亲和素的发现,Biotin and Avidin,20世纪60年代初发现了生物素(biotin)和卵白素(avidin),生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白,生 物 素,环为咪唑酮环，
2、是与亲和素 结合的主要郎部位,II环为噻吩环,有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构,亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，每个亲和素能结合4个分子的生物素,亲 和 素：,生物素的及活化,标记蛋白质氨基的活化生物素 标记蛋白质醛基的活化生物素 标记蛋白质巯基的活化生物素 标记核酸的活化生物素,BNHS（biotinyl-N-hydroxy-succinimide ester）:生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯BCNHS(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate):长臂活化生物素,
3、标记蛋白质氨基的活化生物素：,生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）,BNHS的制备方法：,*生物素+N-羟基丁二酰亚胺,BNHS的结构式,*长臂活化生物素（BCNHS）,生物素与亲和素正常结合,大分子造成空间位阻效应,长臂生物素克服位阻效应,加6-氨基己糖,*生物素酰肼（BHZ）：水合肼+生物素*肼化生物胞素（BCHZ）： 生物素的羰基+赖氨酸的-氨基 生物胞素 生物胞素+无水肼 肼化生物胞素,标记蛋白质醛基的活化生物素：,因在生物素的羧基上带有肼基，故能标记带醛基的蛋白质,标记蛋白质巯基的活化生物素,氯化生物胞素,+,3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-N-BNHS,（DMF）,3-(N-马来酰
4、亚胺-丙酰)-生物胞素(MPB),常用于标记核酸分子的活化生物素有：,标记核酸的活化生物素：,光生物素,生物素脱氧核苷三磷酸,基本类型： 第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为BAB法 第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。 第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法,生物素-亲和素系统的应用,生物素-亲和素系统在ELISA中的应用 BAB-ELISA BA-ELISA ABC-ELISA,依据待检反应体系
5、中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，又分为直接法BAS和间接法BAS。,BAB法：也称桥连亲和素-标记生物素法 （bridged avidin-biotin technique,BRAB ）,*LAB 法：labeled avidin-biotin method,ABC TECHNIQUE,avidin-biotin-peroxidase complex,A:Avidin B:Biotin P:Peroxidase,ABC TECHNIQUE,直接法的ABC法,Ag,Biotinylated primary antibody,ABC TECHNIQUE,间接法的ABC法,Ag,Pri
6、mary antibody,Biotinylated Secondary antibody,生物素-亲和素系统的特点,1高度特异性 2高度灵敏性 3简易、快速、安全、稳定 4应用广泛,1、BAS可与多种标记系统如酶、荧光素、铁蛋白、凝集素、SPA、放射性核素等联合用于抗原、抗体、蛋白、激素、受体、核酸系统等多种生物学反应体系 2、可作为亲合介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化 3、标记生物免疫传感器系统,生物素 - 亲和素系统在分子生物学中的应用 主要集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测用 BAS 制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化将免疫测定技术与 PCR 结合建立免疫-PCR(i
7、mmum-PCR)用于抗原的检测等三方面。,四聚体技术,四聚体技术是指将MHC单体分子四聚体化，提高其亲和力，可与T细胞上的多个TCR相结合的技术。,四聚体（Tetramer）技术,,抗原特异性CTL的分析方法,51Cr释放实验,PCR法,酶联免疫斑点法(ELISPOT),扩增特异T淋巴细胞受体,Tetramer法,间接法 需大量的特异性CTLs作为效应细胞 需体外扩增，周期长，敏感性低， 费时费力 难以广泛应用,敏感性高 但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测,直接法 敏感性高 不受TCR基因型的限制,有限稀释法(LDA),用Tetramer法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5%
8、的CD8+细胞对CMV和EBV特异,可溶性MHC单体分子与TCR的亲和力很低，解离快多价分子可与一个特异性T细胞上的多个TCR结合，使其解离速度大大减慢。,,Tetramer-原理,MHC Class I-HLA-A2,MHC Tetramer,1,2,3,2m,1,2,3,2m,1,2,3,2m,1,2,3,2m,Avidin,Enzymatic Biotinylation Oriented T cell epitope Single Peptide Ligand Specificity Altered at Will,Provided by John Altman,藻红蛋白 phycoer
9、ythrin,生产四聚体的国外著名产家有BD公司, Proimmune及Altman领导的美国四聚体core facility。国内公司有表源生物等。,四聚体技术的应用,四聚体技术使抗原特异性CTL-活性检测达到特异、高效和直接定量的程度，可应用于免疫学研究和检测、特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多个方面。,四聚体技术的应用,(1)作为临床诊断工具，定量检测外周血及组织中抗原特异性CTL的比例，并进行表型及功能分析。通过对抗原特异性CTL的定量检测、表型及功能分析，为阐明病毒感染性疾病、肿瘤及自身免疫性疾病的发病机制奠定基础。,四聚体技术的应用,(2)用于肿瘤过继性免疫治疗： Mei-denb
10、auer等用黑色素瘤抗原诱导潜在的肿瘤特异性T细胞用Tetramer分离，富集 将大量Melan-A肽特异性CTL(42.1)，静脉输注给8例恶性黑色素瘤患者，结果发现外周血单核细胞中抗原特异性CTL的比率由输注的0.010.07升至输注后的2。而且这些细胞能在活体内存活数周，具有分泌INF-7功能，并优先聚集到肿瘤局部发挥作用。 (3)用于疫苗疗效的监测： 近年用抗原肽共孵育处理的树状突细胞作为疫苗，免疫机体从而诱发有效的CTL反应成为研究热点。可用同源肽构建的四聚体监测该疫苗的疗效。,单独采用 tetramer技术虽能反映机体具有高度抗原特异性的 CD8 T细胞群 ，但并不能精确反映机体的
11、保护性免疫状态，必须结合相应的功能实验进行综合评估,电化学发光免疫分析法,Electro-Chemiluminescence Immunoassay (ECLI ),电致化学发光（ECL),电致化学发光 (ECL) 是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。,电致化学发光（ECL),ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。因此ECL反应易精确控制，具有灵活性。,电化学发光剂,定义：指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。 特点 反应在电极进行 化学发光剂：三联毗啶钌 电子供体为：三丙
12、胺（TPA）,三联毗啶钌分子结构图,三联吡啶钌 （ Ru(bpy)32+ ）特点,ECL分析中采用Ru(bpy)32+作为标记物，其活化衍生物是Ru(bpy)32+N羟基琥珀酸胺酯（NHS） ，该衍生物具有水溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。,三联吡啶钌（ Ru(bpy)32+ ）特点,Ru(bpy)32+衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20,仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性； Ru(bpy)32+分子量小，空间位阻小 ，即便小分子的核酸也能标记，使检测的菜单大大丰富，更重要的是为其检测菜单的开发前景提供了广阔空间。,电化学发光原理图,基态,激发态,
13、不稳定,三丙胺,电化学发光免疫分析 (Electro-Chemiluminescence Immunoassay, ECLI),ECLI是继EIA、RIA、FIA、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后的新一代标记免疫测定技术； ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物；,ECLI原理,在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。,ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）,ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合）,ECL
14、IA体系结构图,ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）,ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）,ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）,方法评价,采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 m的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大2030倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快；,方法评价,“链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统，使检测的灵敏度大大提高；,方法评价,利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化； 标记物的再循环利用，使
15、发光时间更长、强度更高、易于测定。,ELIA优越性,高度敏感，可达pgml或pmol水平； 特异性强，重复性好，CV5。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。 操作简单，耗时短，易于自动化。 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。,临床应用,激素 肿瘤标记物 内分泌功能 传染性疾病 其它 如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。,小 结,BAS既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性 检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于各类反应 体系中反应物的分离、纯化。BAS在实际应用中如酶免疫
16、测定、荧光免疫技术、 放射免疫测定及分子生物学中所具有的巨大优越性主要 表现在以下几个方面：灵敏度高、特异性强、稳定性 高、适用性广、无放射性污染。,谢 谢,酶联免疫斑点试验 ELISPOTenzyme linked immunospot , ELISPOT,历史回顾,1971年荷兰学者van Weeman 和瑞典学者Engvall最先建立嗨联免疫吸附试验 (ELISA)，递经完善和拓展，迄今已成为免疫测定中应用最广泛的一项技术。但该法只能刚于液体中抗原或抗体系统的定性和定量测定,历史回顾,1983年 Cerkinsky在上述的基础上，建 立直接检测分泌抗体的杂交瘤细胞的技术，名为ELISPOT，用以初筛产生分泌预定特异性抗体的B淋巴细胞。1988 年他们又将改进的方法用于细胞因子的定量检测，称之为反向ELISPOT，现通称 ELISPOT。,
