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1、第二节 萃 取 技 术,概述,萃取：当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时，生化物质倾向于在两相之间进行分配，当条件选择得恰当时，所需提取的生化物质就会有选择性地发生转移，集中到一相中，而原来溶液中所混有的其它杂质（如中间代谢产物、杂蛋白等）分配在另一相中，这样就能达到某种程度的提纯和浓缩。,一、有机溶剂萃取法 solvent extraction,有机溶剂萃取又称为溶剂萃取，利用样品中不同组分分配在两种互不相溶的溶剂中的溶解度或分配比不同来达到分离、提取或纯化的目的。,萃取过程的理论基础,液-液萃取是以分配定律为基础 分配定律：一定T、P下，溶质在两个互不相溶的溶剂中分配，平衡时，如果
2、其在两相中的相对分子质量相等，溶质在两相中平衡浓度之比为常数。K-分配常数在常温常压下为常数；应用前提条件 （1） 稀溶液 （2） 溶质对溶剂互溶没有影响 （3） 必须是同一分子类型，不发生缔合或离解,实验室溶剂萃取过程,溶剂萃取步骤,工业上萃取操作通常包括三个步骤：混合萃取分离溶剂回收 因而工业萃取的流程中须有混合器(如搅拌混合器)、分离器(如碟片式离心机)和溶剂回收装置(如蒸馏塔)。 一般萃取过程很快，如果接触表面足够大，则在1560 s之内就可完成。 萃取操作流程可分为单级萃取和多级萃取。,萃取步骤及方式,单级萃取,多级逆流萃取流程,多级萃取,多级错流萃取流程,有机溶剂萃取的影响因素,1
3、）影响萃取操作的因素： pH、温度、盐析 2）有机溶剂的选择 3）乳化与去乳化,pH的影响,pH对表观分配系数的影响 pH低有利于酸性物质分配在有机相，碱性物质分配在水相。 对弱酸随pH K 对弱碱随pH K ,温 度, T，分子扩散速度，故萃取速度 T影响分配系数： 1）物质 T 水中的溶解度 萃取时 T使K 2）T影响弱酸、弱碱的解离平衡 T影响两溶剂的互溶度影响,一般生化物质的萃取在室温或较低温度下进行,无机盐的作用： 生化物质在水中溶解度，有利于溶质向有机相中分配。,盐 析作用,有机溶剂的选择,根据相似相溶的原理，选择与目标产物极性相近的有机溶剂为萃取剂，可以得到较大的分配系数； 有机
4、溶剂与水不互溶，与水有较大的密度差，黏度小，表面张力适中，相分散和相分离容易； 应当价廉易得，容易回收，毒性低，腐蚀性小，不与目标产物反应。 常用于生化萃取的有机溶剂有丁醇、丁酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯等。,反胶束（reversed micelles）是表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基束自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。,二、反胶束萃取法 Reversed micellar extraction,反胶束的形成,(CMC):表面活性剂中水溶液中形成胶团的最低浓度critical micelle c
5、oncentration,0.11.0 mmol/L的范围内。在反胶束中有一个极性核心，它包括由表面活性剂极性端组成的内表面、平衡离子和水，被称之为“水池”（water pool）。这个“水池”具有极性，可以溶解具有极性的分子和亲水性的生物大分子,反胶束特点,常用的表面活性剂,定义：由亲水憎油的极性基团（亲水基）和亲油憎水的非极性基团（疏水基）两部分组成的分子。,化学名称是二（2-乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠,AOT（Aerosol OT）,常用阴离子表面活性剂,CTMAB（溴化十六烷基三甲铵或十六烷基三甲基溴化铵）,常用阳离子表面活性剂,TOMAC（氯化三辛基甲铵）,静电引力：主要是蛋白质的表面
6、电荷与反胶束内表面电荷（离子型表面活性剂）之间的静电引力作用。 空间位阻作用：增大反胶束极性核的尺寸，以减小大分子蛋白进入胶核的传质阻力。凡是能够引起静电引力，能够促使反胶束尺寸增大的因素均有利于提高分配系数。这些因素主要是pH、离子强度、表面活性剂种类和浓度、助表面活性剂等,反胶束萃取蛋白质的原理,助表面活性剂（assistant of surfactant ）能改变表面活性剂的表面活性及亲水亲油平衡性，参与形成胶束，调整水和油的极性，水溶性醇可减小水的极性，油溶性醇可增加油的极性，从而影响体系的相态和相性质的微乳成分。 例如，在配制微乳液时的助表面活性剂主要有乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、
7、异丁醇、正戊醇、异戊醇、1-己醇、2-己醇、1-辛醇、2-辛醇、杂醇油、对壬基酚等。 非离子表面活性剂，使它们插入反胶团的结构中，就可以增大反胶团的尺寸，溶解较大相对分子质量的蛋白质。,反胶束溶解蛋白质模型,水壳模型,半岛模型,强烈疏水区,吸附模型,溶解模型,1.液液接触法 即将含蛋白质的水相与含表面活性剂的有机相接触。 2.注入法 将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂的非极性有机溶剂中去。这种方法的过程较快并可控制反胶束的平均直径和含水量。 3.溶解法 对非水溶性蛋白质可用该法。将含有反胶束（W330）的有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌，使蛋白质进入反胶束中，该法所需时间较长。含蛋白
8、质的反胶束也是稳定的。,反胶束萃取操作,反胶束萃取蛋白质的应用,三、 固相萃取,固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和富集的目的。即先使液体样品通过一装有吸附剂（固相）小柱，保留其中某些组分，再选用适当的溶剂冲洗杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。,1.固相萃取的基本原理,固相萃取的基本原理是样品在两相之间的分配，即在固相（吸附剂）和液相（溶剂）之间的分配。 固相萃取保留或洗脱的机制取决于被分析物与吸附剂表面的活性基团，以及被分析物与液相之间的分子作用力。 洗脱模式有两种：一种是目
9、标化合物比干扰物与吸附剂之间的亲和力更强，因而被保留，洗脱时采用对目标化合物亲和力更强的溶剂；另一种是干扰物比目标化合物与吸附剂之间的亲和力更强，则目标化合物被直接的洗脱。通常采用前一种洗脱方式。,2.固相萃取的分离模式,反相固相萃取 正相固相萃取 离子交换萃取 免疫亲和,有机溶剂非极性顺序,正己烷环己烷四氯化碳甲苯苯无水乙醚氯仿二氯甲烷四氢呋喃乙酸乙酯丙酮乙腈异丙醇甲醇水乙酸,反相固相萃取,反相：吸附剂（固定相）是非极性或弱极性的，如硅胶键合C18,C8, C4，C2,-苯基等。流动相为极性（水溶液）或中等极性样品基质。 吸附剂的极性小于洗脱液的极性。 应用：可以从强极性的溶剂中（如水样）萃
10、取是非极性或弱极性的化合物。 作用机理：非极性-非极性相互作用，如范德华力或色散力。,正相固相萃取,吸附剂：极性键合相，如硅胶键合NH2、CN，-Diol（二醇基）；极性吸附剂，如silica、florisil、(A-,N-,B-)alumina、硅藻土等。流动相为中等极性到非极性样品基质。 作用机理： 1）极性-极性相互作用 2）表面硅羟基、铝羟基与极性化合物的极性官 能团之间相互作用，包括氢键，-键等。 3）偶极-偶极相互作用 4）偶极-诱导偶极相互作用 应用：从非极性溶剂样品中萃取极性化合物,硅胶柱(silica),表面SiOH,中等强度的吸附剂，适用于从非极性基体中吸附极性化合物。 硅
11、胶是一种酸性吸附剂，可以吸附酸性（有机酸类）或中性的极性化合物，由于表面的硅醇基可以释放出弱酸性的氢离子，又作为一种弱酸性阳离子交换剂，吸附碱性化合物（生物碱类，胺类）。 活性（吸附性）与硅胶的含水量有关，根据其中含水量不同分为不同的活性等级。 硅胶的活化：加热到100-110度，除去表面吸附的水份，当温度升到500度，表面的硅醇基脱水变成硅氧烷键，从而丧失吸附性 硅胶极亲水：分析的样品溶液必须无水。 备注：硅胶净化时，一般杂质保留在柱上，目标化合 物流出。,正相萃取或反相萃取选择原则,总目的：杂质和待分析物分离 1、受样品基体提取溶剂，要分离的杂质和目标化合物的性质制约 a)物质在柱上的保留
12、（或洗脱）取决于其与吸附剂和样品基体溶剂（或洗脱溶剂）之间亲和力的相对大小。样品基体是强非极性溶剂，如正己烷，二氯甲烷等，一般要选用正相柱分离。样品基体是强极性溶剂，如水和甲醇，乙腈及丙酮的混合液，要选用反相柱分离。,离子交换固相萃取,离子交换固相萃取用于萃取分离带有电荷的分析物 固定相为带电荷的离子交换树脂，流动相为中等极性到非极性样品基质。 分析物与吸附剂间的作用是静电吸引力。 离子交换固相萃取分为阴离子交换固相萃取和阳离子交换固相萃取。,3、固相萃取的操作步骤,一个完整的固相萃取步骤包括固相萃取柱的预处理、上样、洗去干扰物质、洗脱及收集分析物四个步骤。,一是为了润湿和活化固相萃取填料，二
13、是为了除去填料中可能存在的杂质，减少污染。 采取的方法是用一定量溶剂冲洗萃取柱。 反相类型的固相萃取硅胶和非极性吸附剂介质，通常用水溶性有机溶剂如甲醇预处理，然后用水或缓冲溶液替换滞留在柱中的甲醇。 正相类型的固相萃取硅胶和极性吸附剂介质，通常用样品所在的有机溶剂来预处理。 离子交换填料一般用35mL 去离子水或低浓度的离子缓冲溶液来预处理。 固相萃取填料从预处理到样品加人都应保持湿润，如果在样品加人之前，萃取柱中的填料干了，需要重复预处理过程。,a.固相萃取柱的预处理,b.上样,将样品倒入活化后的SPE 小柱，然后利用加压、抽真空或离心的方法使样品进入吸附剂。采取手动或泵以正压推动或负压抽吸
14、方式，使液体样品以适当流速通过固相萃取柱，此时，样品中的目标萃取物被吸附在固相萃取柱填料上。,b.上样,目的是为了除去吸附在固相萃取柱上的少量基体干扰组分。 一般选择中等强度的混合溶剂，尽可能除去基体中的干扰组分，又不会导致目标萃取物流失。 反相萃取体系常选用一定比例组成的有机溶剂-水混合液，有机溶剂比例应大于样品溶液而小于洗脱剂溶液。,c.洗去干扰物质,d.洗脱及收集分析物,选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂以备后用或直接进行在线分析。 为了尽可能将分析物洗脱，使比分析物吸附更强的杂质留在SPE 柱上，需要选择强度合适的洗脱溶剂。,4、固相萃取基本装置,固相萃取的基本装置包
15、括固相萃取柱和固相萃取过滤装置。固相萃取柱是整个固相萃取装置的核心。,（1）固相萃取柱,商品化的固相萃取柱（cartridge）外形类似于一个注射器针筒。还可自行填装固相萃取柱。,（2）固相萃取过滤装置,固相萃取加样过程中，需通过适当的方法使样品溶液通过固相萃取柱，使待分析物吸附在填料上。洗脱过程中，同样需要使溶剂通过固相萃取住，使待分析物解析。以上步骤需借助于固相萃取过滤装置完成，采用柱前加压或柱后加负压抽吸的方式实现。,a.固相萃取过滤-加压操作,固相萃取加压操作可通过在液体样品储液槽上方用高压空气或氮气施加一定压力来实现的。如果样品较少，可以用手动加压的方式实现。,美国Supelco公司提供的给单个固相萃取小柱加压的单管处理塞。,b. 固相萃取过滤-负压抽吸,负压抽吸是在固相萃取柱的出口用注射器手动抽负压，或与水泵或真空泵相连，用泵施加适当真空度，从而使样品溶液抽吸通过固相萃取柱。最常用的是用抽滤瓶实现负压抽吸。,
