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1、南京农业大学 生命科学学院,分 子 生 物 学,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,2,第五章 分子生物学研究法（上）,DNA、RNA及蛋白质操作技术,2018/10/5,2,南京农业大学 生命科学学院,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,3,第五章 分子生物学研究法（上）,2018/10/5,3,南京农业大学 生命科学学院,从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学
2、研究的核心技术。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,4,第五章 分子生物学研究法（上）,2018/10/5,4,南京农业大学 生命科学学院,基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,5,第五章 分子生物学研究
3、法（上）,内容： 重组DNA技术回顾 DNA基本操作技术 RNA基本操作技术 基因克隆技术 蛋白质组与蛋白质组学技术,2018/10/5,5,南京农业大学 生命科学学院,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,6,第一节 重组DNA技术回顾,2018/10/5,6,南京农业大学 生命科学学院,三大成就 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗
4、传信息的流动和表达。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,7,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,7,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,8,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,8,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,9,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,9,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,10,第一节 重组DNA技术回顾,重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。 限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI
5、是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 早在1967年，世界上有5家实验室几乎同时报道了DNA连接酶。,2018/10/5,10,南京农业大学 生命科学学院,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,11,几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,12,DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a. DNA的粘性末端；b. DNA的平末端； c. 化学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,
6、13,第一节 重组DNA技术回顾,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。 获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖,2018/10/5,13,南京农业大学 生命科学学院,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,14,第一节 重组DNA技术回顾
7、,重组DNA实验中常见的主要工具酶,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,15,第二节 DNA操作技术,1. 核酸凝胶电泳技术 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。 基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白
8、质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,16,第二节 DNA操作技术,1. 核酸凝胶电泳技术 在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,17,第二节 DN
9、A操作技术,1. 核酸凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,18,第二节 DNA操作技术,溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼
10、脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,19,第二节 DNA操作技术,普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,20,第二节 DNA操作技术,2. 细菌转化与目标DNA分子的增殖 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 将快速生长中的大肠杆菌置于经0预处理的低渗氯化钙溶液中，使细胞
11、膨胀形成原生质球，与外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。42下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,21,第二节 DNA操作技术,2. 细菌转化与目标DNA分子的增殖 细菌转化方法除了上述的CaCl2还有电击法，利用电脉冲使细胞膜穿孔，外源DNA进入从而实现转化。 利用噬菌体颗粒能够有效将DNA注入到宿主细胞这一特点，科学家又发明了DNA分子的体外包装法。如右图,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,22,第二节 DNA操作技术,3. 聚合酶链式反应 聚
12、合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。 基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。新合成的DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的
13、最高值是2n。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,23,第二节 DNA操作技术,3. 聚合酶链式反应 具体过程： 首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（约94）环境下加热1min，使双链DNA变性，形成单链模板DNA； 然后降低反应温度（约56）冷却1min，使引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端互补序列位置上； 最后，72左右保温1至数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5 3方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成后可以拿到产物。,20
14、18/10/5,南京农业大学 生命科学学院,24,多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,25,第二节 DNA操作技术,4. 实时定量PCR 具体实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例,增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物
15、量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,26,第二节 DNA操作技术,4. 实时定量PCR 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。 实时荧光定量pcr技术中的一些重要因素： Ct值。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 Ct值与起始模板的关系，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。可利用来计算出该样品的起始拷
16、贝数。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,27,实时荧光定量PCR中荧光化学，荧光定量pcr所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,28,TaqMan荧光探针,SYBR荧光染料,2018/10/5,南京农业大学 生命科学学院,
