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1、临床基因扩增技术的应用,四川省临床检验中心 杜 琼2012、03,基因扩增技术的应用,该技术在临床上的应用近30年成熟 应用十分广泛-工、农、法、考古、医学。,在临床方面的应用,内源基因的检测-体内（易感基因） 外源性基因的检测-体外侵入（耐药基因） 基因配型的检测-相似程度（亲子鉴定）,如何利用好PCR技术？,熟悉PCR技术的基本原理 认识PCR技术的特点 各种检测项目的价值 了解PCR技术的影响因素 理解检测结果的临床意义,基本原理,以DNA为例 （1）DNA变性： （2）降温退火： （3）引物延伸：,原理 第一步 加热变性,预处理,第二步 引物与靶序列退火,第三步 - 引物延伸,第1个
2、PCR 循环完成后 得到两个拷贝的靶序列,30次循环后靶序列扩增的数量,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,荧光PCR的原理,PCR技术的特点,灵敏度高特异性强快速简便应用范围广,临床应用,肝炎病毒 优生优育 性病病原体 呼吸道病原体 其他病原体,HBV的Dane颗粒形态 （完整的病毒，具有传染性）,HBsAg,HBcAg,HBV DNA,DNAP,（外膜蛋白）,（核衣壳蛋白）,肝炎病原体检测的意义,HBV、HCV 1、了解肝炎病
3、毒在体内存在的数量。传染？复制？治疗？ 2、肝功能异常是否由肝炎病毒引起？早 期诊断（窗口期）的感染者。 3、基因分型可选抗病毒药物 。,4、判断药物治疗的效果。 5、进行HBV分子流行病学研究。,传统检测乙肝、丙肝病毒的指标,抗原或者抗体：两对半、前S1、S2、HCV抗原、抗体。 肝功能 其他指标,HBV基因型的特征,B型 C型 流行性 低 高 HBeAg阳性率 低 高 HBeAg自然清除时间 短 长 HBV DNA 载量 低 高 致病性 轻 重 HCC发生率 低（低年龄组高） 高（高年龄组高） 干扰素治疗完全应答率 高 低 抗病毒治疗效果 高 低 肝癌手术治疗预后 好 差 癌栓栓塞治疗效果
4、 好 差,优生优育指标,HCMV、TOX、RV、HSVI、HSVII 孕期感染ToRCH病原体后，一般以隐性感染为主，无明显症状，不易识别。 引起胎儿感染，导致流产、死胎、死产或胎儿生长迟缓、畸形。,ToRCH抗体的检测：不能分辨感染时间。 不能作为终止妊娠的指标。 无法进行早期诊断。,性病病原体,CT、UU、NGH、 HPV、 TP人乳头瘤病毒分型（HPV）人乳头瘤病毒6、11型尖锐湿疣人乳头瘤病毒高危型-宫颈癌梅毒螺旋体（TP）,CT、UU、NGH、 HPV、 TP 除NGH可培养外，其余难培养或者不能培养。 即使能培养，所需时间长48小时。,看看这些英年早逝的艺人，她们死于宫颈癌宫颈癌的
5、知晓率在不断提高。,梅艳芳(40岁),国家一级演员 李媛媛(41岁),呼吸道病原体的检测,TB、MP、CP、SARS、H1N1 TB-DNA可以对结核病人早期诊断可以鉴别诊断肺结核和肺癌结核与其他分枝杆菌区分对含菌量低的标本的分离,TB：抗体- TB：培养几天报阴 TB：涂片阳性 MP、CP：无法培养 MP、CP：抗原抗体检测交叉反应,其他病原体的检测,EB、HP、EV71、EV、Cox A16 EB：在人群中广泛感染，主要通、过唾液传播，也可经输血传染。青年期发生原发感染，约有50%出现传染性单核细胞增多症，发热、咽炎和颈淋巴结肿大。,40岁以上中老年人检测出与鼻咽癌关系 密切 。慢性疲劳综
6、合症有关,不合格标本带来的后果,检验结果解析,HBV-DNA定量结果 定量测定，测定的是病毒量的“多”或“少”； 结果报告方式： 多少？，多少？具体值？,举例,例如：试剂盒检测范围是103108IU/ml,我们测定的阴性结果应报告 103 IU/ml；（无、含量低）。中间值报告具体数据；当含量高于最高检测限时，报告108 IU/ml。 （ 108 IU/ml； 109 IU/ml ）参考范围?,IU/ml与COP/mlD的换算-咨询厂家3.5E+05 IU/ml-表示一毫升血清中有350，000个HBV病毒微粒。,HBVDNA的变化,在患者治疗过程中检测HBVDNA定量，一般认为：其结果相差5
7、倍属正常波动，结果相差降低10倍以上才算治疗有效。,例如1,有一患者治疗前检测HBV-DNA定量为8.8E+06 IU/ml，治疗一月后复查为2.3E+07 IU/ml，两结果相差2.6倍。（不一定是高了？） 如何向病人解释： 属正常波动或者检测误差（允许误差）,例如2,一患者治疗前检测HBV-DNA定量为9.2E+06 IU/ml；治疗一月后复查为2.8E+06 IU/ml，两结果相差3.3倍，不能说明治疗有效，需要继续观察。要有明显的下降趋势。,PCR技术的新认识,PCR 技术诞生以来，应用广泛，同时不断发展与完善，解决了以往PCR 的瓶颈问题：灵敏度、假阳性。防污染问题：假阳性的解决。它
8、将作为常规检验方法进行全面普及，发挥积极的作用。,严格管理,作为二类医疗技术的管理-技术准入 实验室技术人员的上岗培训 质量体系文件的建立 实验室的标准化设置 检测试剂的审批,临床基因扩增实验室平面图,标本接收区,试剂准备区,核酸提取区,核酸扩增区,产物分析区,专用通道,缓冲区,缓冲区,质量手册 程序文件,SOP,文件记录归档,各级室间质评价,重要性,医院等级评审的指标之一。 学术论文发表的核心技术。 早期、快速诊断疾病的有效指标。 药物治疗效果观察的监测手段。,期 待,我们医院通过这次学术交流，充分认识PCR技术，利用该技术更好地为患者服务。提高诊断和治疗水平，获得理想的社会效益和经济效益。,Thank you!,
