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1、1蛋白相互作用蛋白相互作用 Pull-Down 实验实验实验原理实验原理：Pull-Down 技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down 实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标签就是用于 Pull-Down 实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽 S-转移酶（GST）和多组氨酸（6His） 。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如 Ni2+和 Co2+） 。2实验准备：实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离
2、子琼脂糖凝胶） 、离心机、实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、 200mM NaCl、 1mM EDTA（pH8.0） 、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。 （蛋白酶抑制剂：2ug/ul 抑肽酶（aprotinin
3、） 、1ug/ul 白胃素（leupeptin） 、0.7ug/ml 胃酶抑素（pepstatin） 、25ug/ml 苯甲磺酰氟（PMSF） ）实验方法：实验方法：方法一：方法一：1、预清除细胞裂解液：将细胞裂解液与 50ul 的 50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和 25ug GST 在 4混合孵育 2h。离心机 12,000g 在 4离心 2min。将上清转移至新的离心管中。2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及 50ul 谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在一管中加约 10ug 的 GST 蛋白，另一管中加约 10ug 的 GST 融合探针蛋白。两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该
4、是等摩尔的。将离心管在 4翻转混合孵育 2h。最大速度在 4离心样品 2min。在新的微量离心管中收集上清。用 1ml 冰冷的裂解液洗球珠。在离心机上以最大速度离心 1ml。弃去上清。重复洗三次。加入 50ul 20mmol/L 的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱 GST 融合蛋白及任3何与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心 2min。将洗脱蛋白质与等体积的 2SDS-PAGE 上样 buffer 混合。3、检测相互作用蛋白质将样品煮沸 4min，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳分析。方法二：方法二：1、5ug 目的 GST 融合探针蛋白和 GST 蛋白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠在 4孵育结
5、合 30min。2、结合 GST 融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与 100ul 细胞裂解液结合在 4作用 4h。3、3000rpm 在 4离心 5min，除去上清。4、用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm 在 4离心5min，除去上清，重复 5 次。5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行 SDS-PAGE 电泳分析。方法三：方法三：实验试剂：PBS（140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4）Elution Buffer: 50mM Tris-Cl(pH8.0)、10mM 还原型谷胱甘肽0.154g 溶解到 50ml 50mM
6、 Tris-Cl(pH8.0)中配制 Elution Buffer。1、细胞裂解取 1ml 细菌培养液离心去上清，加 200ul 细胞裂解液到菌丸，在室温下重悬并轻柔的混匀。将其在室温下晃动孵育 20-30min。2、固定 GST 融合蛋白到柱子上将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取 20ul 到 1.5ml 离心管中，小心去除上清，加 250ul Binding Buffer 或 wash Buffer 到凝胶中，混匀。重复洗 3 次以上。平衡好的凝胶用 100ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。加 200ul 含GST 融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温
7、下孵育 30min。4小心移去上清， （保存以便分析， ）将 250ul Binding Buffer 或 wash Buffer加到凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育 5min。小心移去上清。加入250ulBinding Buffer 或 Washing Buffer 再次清洗，将凝胶用 20ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。3、捕获猎物蛋白将 5ul 固定 GST 融合蛋白的凝胶中加入 20ul 含猎物蛋白的溶液，将 155ul Binding Buffer 或 wash Buffer 和 20ul 10%BSA 加入凝胶中，在室温下旋转孵育 1h。移去上清
8、。将 400ul Binding Buffer 或 wash Buffer 加入凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育 5min，移去上清。加 400ul Binding Buffer 或 wash Buffer 再次清洗凝胶。小心移去上清。分析：加 20ul SDS-PAGE loading Buffer，在室温下混合 5min。取出上清用于分析。His Pull-Down 方法方法实验试剂：Binding Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、150mM NaCl、20mM 咪唑Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、300mM NaCl、500m
9、M 咪唑实验步骤：实验步骤：1、结合蛋白裂解后，经 0.45um 滤膜过滤，2、与 Ni-NTA 树脂（1ml 蛋白裂解液上清结合 5ul 树脂）4混合孵育 3h。3、待树脂沉淀后用 10 倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液洗去杂蛋白。4、用 6 倍柱体积镍柱洗脱目的蛋白。5、纯化后的蛋白用 PBS 和超纯水透析，冻干。6、SDS-PAGE 电泳分析7、纯化的蛋白与 Ni-NTA 树脂冰浴作用 2h，8、10 倍柱体积洗涤缓冲液洗涤，9、然后加入过量 100ug/ml 蛋白溶液，冰浴作用 2h，510、用 10 倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，11、加入 1 倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，12、洗脱蛋白进行 S
10、DS-PAGE 和 Western-blot 分析鉴定。13、阴性对照为结合蛋白溶液加入 Ni-NTA 树脂中冰浴作用 2h。10 倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，加入 1 倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，注意事项：注意事项：1、所有过柱的液体都要经过 0.45um 或 0.22um 的滤膜。2、平衡柱子：、平衡柱子：2.1 用 3-5 个柱体积蒸馏水洗柱2.2 用 3-5 个柱体积的 binding buffer 平衡柱子。3、洗柱：、洗柱：如谷胱甘肽琼脂糖凝胶的柱子失去结合能力，需要洗去柱子上的杂质3.1 除去变性物质，用 2 个柱体积的的 6M 盐酸胍洗柱子，然后用 5 个柱体积的 PBS 洗柱3.2 除去疏水性物质，用 3-4 个柱体积的 70%乙醇或 2 个柱体积的含1%Triton X-100 的 PBS 洗柱，然后用 5 个柱体积的 PBS 洗柱4、柱子的保存、柱子的保存用 3-5 个柱体积的超纯水洗柱后，用 3-5 个柱体积 20%的乙醇洗柱后将柱子保存于 4冰箱5、Ni 离子柱的洗柱程序和柱子的保存同带 His 标签融合蛋白纯化的步骤。
