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1、1,免疫组织化学技术,IHCTImmunohistochemistry technique 定义：在组织细胞原位，通过抗原/抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标志物，对被检测抗原/抗体进行定性、定位和定量检测的免疫学测定技术。 特点：结免疫学反应特异性和组织化学可见性为一体；借助先为显微镜放大，于细胞或亚细胞水平测定抗原/抗体。,2,免疫组织化学技术,类型：酶免疫组化技术荧光免疫组化技术免疫电镜技术亲和免疫组化技术（标记物等的不同）实例：,3,4,5,一、免疫组化技术介绍,（一）标本制作 （二）抗体的选择 （三）抗原/抗体反应 （四）改善标本的通透性 （五）对照项的设立 （六）检测结果的
2、判断,6,（一）标本制作,标本 指固定在玻片上用作为抗原的，如组织、细胞或微生物。,7,标本的类型 组织切片、印片、涂片。,1.印片法： 优点：操作简单，抗原保存好 缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背 景染色。,8,2.组织切片,组织切片-冷冻切片/石蜡切片介绍： 特点：组织新鲜、速冻，恒温冷冻切片机片厚510m，-20保存；后者只要求固定的标本，经脱水+浸蜡包埋常温切片机，片厚23m优点： 前者抗原丢失少，结构保证完好；后者片薄观察结构清晰，宜连续性可作回顾性研究。缺点： 前者细胞清晰度差，现用难保留；后者抗原量少，易出现非特异着色，需前处理。,9,1).切片前的准备工作 (1)载玻片的
3、清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶。,10,(2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片丙酮5min APES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保存备用。,11,切片要求及注意事项： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)5260烤片18h。 (3)切片厚24m。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4保存数年（石蜡切片）,12,标本的固定,标本固定需达到目的：细胞内蛋白凝固终止胞内酶活性保持细胞固有
4、态除干扰性类脂等 理想固定剂：能快速固定细胞抗原防止抗原物质扩散固定后抗原的特性不改变 例：10%中性福尔马林液、丙酮、乙醇,13,标本的保存（温度、时间）,1.冷冻保存： 2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管 中，-80冻存。 3.蜡块的保存 4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。,14,标本的预处理（目的、注意点）,为什么要进行酶消化和抗原修复？ 醛键形成 羧甲基形成 甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变
5、，而影响检测。,15,抗原修复(Antigen Retrieval;AR),1 酶消化 (1)原理： 1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白 2)断交联(2)蛋白酶的种类,16,胰蛋白酶 0.05%0.1胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1N NaoH调pH至7.8。消化时间37 30min。胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶，用0.1N HCI稀释，消化时间37 30180min。 蛋白酶K 20g/ml，用pH8.0 0.5M Tris-HCI配制，消化时间37 2040min。链酶蛋白酶 0.1%，用pH 7.4,0.5M Tris-Hcl稀释，消化时间37 14h。 无花果蛋白酶 0.1%浓度，用
6、0.2M pH7.4 PBS稀释，消化时间37 3060min。,17,（二）抗体的选择,第一抗体（一抗）：高特异性、高效价、多克隆。高特异性针对性强，靶的明朗高效价稳定性好，反应时间长；适宜稀释可减少干扰。多克隆（动物免疫血清） 针对多为点，易检出。,18,市售抗体的种类某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如-胰蛋白酶 有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。 近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔源性,19,标记抗体,在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到 标记物种类：荧光素
7、：异硫氰酸荧光素或罗丹明酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶金属离子：胶体金颗粒 标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性，从而使染色敏感性降低,20,抗体的保存 商品化一抗或自制一抗均需加入防腐剂，在4中保存一年其质量不会有太多的改变，如一次购置量大，可10l/支分装，标上号，-40保存备用。 抗体的配制,21,抗体最佳稀释度的测定 直接测定法,一抗稀释度 特异性染色 非特异性染色1:50 + +1:100 + +1:200 + +1:400 + +1:500 + ()阴性对照 () (),22,（三）抗原/抗体反应（温育）,保证抗原/抗体反应有效进行的关键。 温度：37（60min）/4
8、（过夜）/微波炉（5min） 湿度：湿盒 避光：,23,（四）改善标本的通透性,通透性:指与大分子抗体反应时,其通过细胞膜的能力。 通过表面去垢剂，如NP-40、TritonX-100使得细胞膜的通透性增强，或通过反复冻-融操作 通透性处理的方式（试剂、浓度、时间）与标本固定方法相关。,24,（五）对照项的设立,设对照的意义：为排除各种可能干扰因素的影响，正确评估检测结果。 阳性对照：选已知某抗原阳性的切片等作同步检测操作，结果必须显示应当出现的阳性表现。 阴性对照：1、空白对照2、替代试验3、吸收试验,25,（六）检测结果的判断,阳性结果的定位明确，如细胞核（病毒）？细胞膜（受体）？细胞浆（
9、表达蛋白）？ 阳性结果的分布规律，特异性着色局限且有规律；非特异着色无规律、无界限，定位不准确。 阳性结果的强度,26,27,二、酶免疫组织化学技术,（一）酶标记抗体免疫组化染色法 1、直接染色法 （一步法） 2、间接染色法（二步法） （二）非标记抗体酶免疫组化染色法 1、酶桥联法 2、过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法 3、双桥PAP法 4、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）,28,二、酶免疫组织化学技术,酶标记抗体免疫组化染色法：指将酶通过交联剂共价连接在抗体分子上酶标抗体酶标抗体+切片上抗原+底物酶催化底物等显色并沉淀其中，可定性、定位、定量。酶标记抗体为一抗（直接）酶标记抗体为一
10、抗（间接）,29,（一）酶标记抗体免疫组化染色法 1、直接染色法 （一步法）： 原理：待检标本+酶标记抗体+底物显色 技术要点：除内源性酶、封闭、镜下观察,30,直接法,将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，没有联结系统、未用桥抗体。 优点：特异性高、非特异染色轻。 缺点：敏感性低，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记,31,2、间接染色法 （二步法）： 原理：待检标本+非标记特异性一抗+酶标记二抗+底物显色 技术要点：同前,Primary Antibody,32,间接法,将标记物标记在桥联抗体上（即二抗、三抗） 一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体，其酶标抗体必须是针对兔 优点：敏感性高，只
11、需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配 缺点：特异性差,33,（二）非标记抗体酶免疫组化染色法非标记抗体酶免疫组化染色中，酶不是直接标记在抗体（一抗/二抗），而是经抗酶抗体与酶结合，它既用于抗原检测，也可用于抗体检测。 常见的：1、酶桥联法；2、过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；3、双桥PAP；4、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）,34,1、酶桥联法:Ag-Ab1-Ab2-Ab(E),35,2、过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法:,组成： 一抗是针对靶抗原的特异性抗体 二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结PAP复合物 三抗是以过氧化物酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产生的
12、抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（PAP）,36,酶 抗酶抗体复合物,通过免疫反应而不是化学方法，将酶结合到抗体上，形成具酶活性的免疫复合物。如PAP复合物（Peroxidase AntiPeroxidase Complex），PAP复合物属非标记性，保护了酶的活性，比免疫荧光法敏感上千倍。,37,PAP,Primary Antibody,Secondary Antibody,Peroxidase-anti-Peroxidase,38,特点： 未经化学交联不影响抗体和酶的活性 由2个抗酶抗体和3个酶分子，稳定性好 本身不存在游离免疫球蛋白，非特异少 但复合物制备繁琐,39,优点：PAP复合物
13、中含酶更多，且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高 PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色 可用于福尔马林固定的石蜡切片,40,3、双桥PAP法: PAP的改良呈Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP敏感性提高, 操作太复杂。,41,双PAP法,42,4、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）与PAP法相似，其用的是碱性磷酸酶 （AP）。AP代HRP-除内源性酶干扰，特异性高成本高（制备过程复杂）。,43,APAAP法,44,三、免疫电镜技术,Immunoelectron microscope（IEM）技术是
14、利用电子显微镜的高分辨力，能够清晰揭示抗原-抗体特异性复合物，呈现高度精确、灵敏且特异的结果。 标记（示踪）物：铁蛋白、胶体金等标记抗体+抗原不溶性复合物,45,免疫电镜成功的关键： 细胞超微结构要求保存完好 细胞或亚细胞结构的抗原位点保持不变 免疫试剂应选择通透性好 标记免疫物与待检抗原结合性好（特异、稳定）,46,三、免疫电镜技术（方法）,1、铁蛋白标记免疫电镜技术,含铁25%，分子量450KD 核心4个亚基，电子密度高 铁原子的电子散射力大，镜下反差大,47,1、铁蛋白标记免疫电镜技术 原理：铁蛋白标记抗体，保留抗体免疫活性并具高电子密度，与待检抗原结合，在电镜下易见。 技术要点：铁蛋白
15、标记抗体的制备标记方法：A、一步法B、二步法 免疫电镜样本的制备制备法：A、包埋前免疫染色B、包埋后免疫染色,48,免疫电镜样本的制备中包埋前免疫染色： 固定免疫组化染色包埋、切片镜检免疫电镜样本的制备中包埋后免疫染色： 固定包埋、切片免疫组化染色，镜检,49,2、酶标记免疫电镜技术,电镜下酶标记免疫染色图,50,酶标记免疫电镜技术是将电镜高分辨力与酶 免疫技术的高灵敏与特异性相结合 常用酶：水解酶氧化酶（HRP）+ DAB（底物）转化酶 DAB 3、3二氨基联苯胺。易氧化聚合系 列反应后+锇酸高电子密度的锇黑。 技术分类:(用否酶标抗体、何时用？),51,1）酶标记抗体包埋前免疫染色法,酶标记免疫组化染色间接法实验原理示意图,52,2）非酶标记抗体法（PAP法） 不是用酶直接标记的抗体，而是用（酶蛋白：抗酶蛋白抗体）自然结合物； 操作包括包埋前免疫染色/包埋后 复合物分子大，穿透组织细胞能力？ 酶反应的产物会发生扩散？,
