《药效学实验设计》由会员分享，可在线阅读，更多相关《药效学实验设计（32页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、药效学实验设计,吴勇杰 兰州大学基础医学院药理学研究所 甘肃省新药临床前研究重点实验室,药理实验设计三原则：,对照control 随机random 重复replication,一对照（control）,1 自身对照：是在同一个体身上观察给药前后某种指标的变化，此种对照可减少个体差异，但不能克服随时间而变的因素的影响。如肝炎有自愈倾向，给药后肝功好转不一定是药物的作用，故自身对照实验可能会得出错误结论。除非有可靠证据说明检测指标不随时间而变或同时设组间对照，否则不宜使用自身对照。,2 组间对照：是实验中设若干平行组，进行各组间比较。这种设计符合平行对照的原则，最为常用。 组间对照实验设计： 1正
2、常对照组（或阴性对照组，或空白对照组）：正常动物，给药物赋型剂。给药途径同给受试药组。 2模型对照组：如制备肝硬化、高血压、心肌梗塞等。不用药物治疗，给赋型剂，给药途径同给受试药组。 3阳性对照组：制造动物病理模型，给已知药物作对照。,一对照（control）,阳性对照药的选则：选已知药物，如研究目的是报批新药，应选已批准上市的药物作对照；如系理论研究，可选未上市药物。所选药物尽量是同类药，以便比较作用强度，或公认的有效药物，如抗溃疡药研究一般选法莫替丁。如抗癌药研究一般选环磷酰胺。 设阳性对照组的目的： 考察实验方法的可靠性、稳定性。 考察受试药的作用性质、强度，从而发现受试药的优缺点。 阳
3、性对照药的剂量选则：如要比较阳性药与受试药的作用强度，应设多个剂量组。如受经费等的限制，也可设一个剂量组，但此时设阳性对照组的作用只是考察方法的可靠性，不能得出受试物作用强弱的结论。 阳性对照药的给药途径，如能做到，尽量同受试药组。,一对照（control）,要使对照组与实验组具有可比性，必须符合一致性原则： 除处理因素不同外，非处理因素应均衡一致（同时、同地、同条件、同种、同批、同病情）,一对照（control）,在用动物疾病模型（如高血压）实验时，在动物A的基础上加了处理B高血压，加上溶媒C，故欲判定药物D的作用，给药组的设计必须满足下述设计： 模型对照组：A+B+C 药物实验组：A+B+
4、D,一对照（control）,为了判定实验模型的成功与否，即此指标的变化（血压升高）是否是由于造型的结果还是自发性波动，必须另设空白对照组。故更完整的实验设计应如下： 空白对照组：A+C 模型对照组：A+B+C 药物实验组：A+B+D,一对照（control）,空白对照并不是不给任何处理的对照，而应施以和受试组相同的操作条件，如动物的质量、饲养条件、药物溶媒、给药途径、给药次数、手术过程。,二随机（Random）,随机包括随机分组和随机操作。 1随机分组： 随机分组就是按照机遇原则来进行抽样或分组，其目的是使一切干扰因素分配到各组时只受纯机遇的抽样误差的影响，由于机遇对每个组来说是相等的，未知
5、因素可对每个组产生影响，使每个组的同一指标平行增加或减少，这就避免了实验者主观因素或其它偏差性误差的影响。如观察药物对大鼠实验性胃溃疡的影响，应先造成大鼠胃溃疡模型，然后将已成型动物随机分配到各组中，从而避免了造型过程中人为的影响。对于短时内难完成的造型，应先确定随机顺序，按随机顺序操作，并将动物按随机顺序分配到各组。,二随机（Random),随机化手段可用随机数字表，这在一般统计学书上均可捡索到。也可用电脑统计学软件生成。 近年来提倡均衡下的随机（随机区组法），即先将能控制的因素（性别、体重、病情严重程度等）均衡地分档，然后在每一档中随机取出等量动物分配到各组，使哪些较难控制因素（如活泼程度
6、、饥饱程度、疲劳程度）得到随机安排。,二随机（Random),典型分组举例： 某实验者有小鼠60只，各半，体重18-22 g, 欲分为6组，如何分组？ 分别将鼠分开，各一笼，每笼30只。 2将鼠30只按体重分笼，分别为18g, 19 g, 20 g, 21 g, 22 g,共5笼。每笼有同一体重鼠4-8只。,二随机（Random),3按电脑统计软件，生成随机顺序如下： 第一批：6，3，2，4，1，5 第二批：1，4，5，3，2，6 第三批：4，5，2，3，6，1 第四批：2，4，5，3，1，6 第五批：3，6，1，5，2，4,二随机（Random),4.备好6只鼠笼，分别标为A.正常对照组，B
7、.模型对照组，C.阳性对照组，D.某药低剂量组，E.某药中剂量组，F.某药高剂量组。 5. 从18 g笼（如有4只小鼠）开始取小鼠，按第一批随机顺序，依次放入F组、C组、B组、D组。A组和E组各缺1只鼠，从体重最为接近的19 g笼中取出，依次放入A组和E组。第二批和第五批随机方法依此类推。 重复上述过程，将30只鼠随机分入6个实验组中。分组结果，各实验组小鼠同性别鼠数量相等，各组平均体重相近，各组在不同体重档次中的小鼠数相近。各组鼠的营养状态及活泼程度接近。,二随机（Random),2随机操作： 实验过程如可能受随时间变化而变化的已知和未知因素的影响，则操作过程的顺序（不论是组间或是组内）也应
8、是随机的，不应按一固定顺序进行，否则会出现顺序误差。 操作典型错误举例： 某实验者进行抗心肌梗塞实验，60只大鼠，分为6组进行冠状动脉结扎，分别分为假手术对照组（只开胸不结扎冠状动脉）10只、模型对照组10只，阳性对照组10只，药物低、中、高剂量组各10只。实验时按组别顺序依次对第1-6组进行手术。,二随机（Random),错误：该实验各组手术依次进行，未遵照随机操作的原则，实验结果可能会受随时间变化因素的影响，如受麻醉、动物体内生理状态（如血糖水平）的时晨变化、环境的经时性变化，如室温等。这些因素可能导致顺序误差。体外实验如一次操作时间短（如在一个细胞培养平板上的操作），对指标不发生影响时，
9、可以顺序操作，此时应严格控制实验条件，使其稳定不变，特别是环境变化。样品数不宜过多，以便缩短操作时间。体外实验如在短时间内分批进行（如在几块细胞培养平板上的实验），每批均应同时做对照组，以消除顺序误差。 正确的操作顺序：共分10批进行。第1批手术动物，每组各做一只（平行操作），各组顺序随机排列。第2-10批如法进行。,三重复,药理实验的结果应能稳定地重现出来，重现实验过程称重复。重复有二个含义：一是只做一批实验，在不同个体身上重复，如每一实验组要做多只动物，小鼠和大鼠一般每组要在10只以上，这种重复适合于绝大多数实验。另一种重复的含义是，每次每组做10只 小鼠（体内）或4管样品（体外），反复重
10、复3次，这主要是一些特殊实验的要求，如抗肿瘤药的研究。,三重复,重复时要求每组要有足够的动物数或标本数，不同实验要求的样本数不同，基本规律是实验个体的指标变异愈小，则均数的标准差愈小，所需样本数愈小，反之要增大样本数。一般说来，计量资料从每个个体中获得的信息多，所需样本数小，计数资料对信息浪费大，所需样本多。预试时对照组与实验组有差别，但显著性检验时P0.05,可能系样本数不足所致，正式实验时可增大样本数，如组间确有差异，样本数增大后可达显著性水平，如组间确无差别存在，样本数增大后对照组与实验组在预试时出现的差别就会消失。至于增大到多少合适，应参考预试结果进行统计学运算，运算方法可参考药理实验
11、方法学（第2版）第177页“实验设计中的样本数问题” 一节。,三重复,重复实验时要严格控制实验条件，在各次重复中使条件尽量前后一致，严防干扰因素对各批实验的影响。应控制的干扰因素包括：（1）动物：品系、性别、体重、年龄、饲料、饲养环境，（2）药物：批号、剂量、溶解度、稳定性、注射容量、注射速度、酸碱度、温度、保存条件。（3）仪器：灵敏度、精确度、零点飘移、电压稳定性及操作熟练程度。（4）环境：室温、气压、湿度、季节，甚至实验的上午或下午、动物的群养和独养也影响实验结果。,四 剂量确定,受试药组：制造动物病理模型，给未知药物。 剂量组：至少设2个剂量组，一般在三个剂量组以上。 剂量的选则：剂量的
12、最终确定，应以预试结果为据。在进行预试时，可参考下列方法： （1）根据文献资料，参考结构类似药物的有效剂量。 （2）根据文献资料，参考本药在其它实验模型中的有效剂量。 （3）参考LD50，主要药效试验时一般应1/31/5LD50,如有效剂量接近LD50，所测实验结果应用价值不大。 （4）参考药动学数据，从有效浓度推算有效剂量。,（5）参考人用量推算：,早在十九世纪末年，生理学家Voit 氏等发现虽然不同种类的动物每kg体重单位时间内的散热量相差悬殊，但都如折算成每m2体表面积的散热量，则基本一致。例如马、猪、狗、大鼠和人的每m2体表面积每24小时的散热量都在1000 kCal 左右。药理学家研
13、究药物在体内的作用时则习惯于以mg/kg 或g/kg等方式来计算药物的剂量。这种办法行之于同种动物的不同个体时，问题似乎不大；但用于不同种类动物时，常常会出现严重偏小或偏大，以致无法完成实验。1958年Pinkle氏报告6-MP等抗肿瘤药物在小鼠、大鼠、狗和人身上的治疗剂量，按mg/kg计算时差距甚大，但如改为按mg/m2体表面积计算，就都非常接近（见表2-5），此后，按体表面积计算剂量的概念逐渐为药理学家接受，被认为尤其适用于不同动物之间剂量的换算。,动物的体表面积的一般计算法：,从体重推算体表面积，一般认为Meeh-Rubner公式较为合适： A=k(W2/3)/10,000 式中A为体表
14、面积，以m2计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，小鼠和大鼠9.1,豚鼠9.8, 兔10.1，猫9.9, 狗11.2, 猴11.8,人10.6。应当指出，这样计算出来的体表面积仍是粗略估计，不一定完全符合实测数据。,例：试算一体重为1.5 kg的家兔的体表面积： 解：A=10.1(15002/3)/10,000 log A= log 10.1+2/3 log 1500log 10000=0.8783 A=0.1324 m2,人或动物之间药物剂量的换算： 为使用方便，可按“mg/kg折算 mg/m2的转换因子”进行换算：,由上表可见，按mg/kg剂量折算成等效剂量，人为小鼠的1/
15、12，大鼠的1/6， 家兔、猴的1/3，狗的1/2。,高低剂量的确定： 如已知某药的剂量范围，进行药效对比时，一般选中效剂量；进行拮抗实验或解毒实验时，剂量应偏高；进行多药协同实验时，剂量应偏低。,量效曲线测定时的多剂量确定： 一般方法，确定最适剂量时应从小剂量开始（产生20%左右的疗效），在离体器官上按3倍或10倍递增，在整体动物上按2倍或3.16倍（10=3.16）。不同药物有不同的量效曲线斜率，故递增比例不同，一般应按等比级数递增。在预试中确定了最小有效量A、最大有效量B、欲分组数N的情况下，各组间的剂量比r可按下式求出。 r= 各组剂量分别为a,ar,ar2,ar3,例如：如某药A=1
16、 mg/kg, B=10 mg/kg, 剂量组N=3,则计算剂量比如下： r= = 3.16 剂量分组如下： 低剂量组：剂量为a: 1 mg/kg 中剂量组：剂量为ar: 13.16=3.16 mg/kg 高剂量组：剂量为ar2: 13.163.16=9.985610 mg/kg,错误设计举例： 低剂量组：剂量为 1 mg/kg 中剂量组：剂量为 5 mg/kg 高剂量组：剂量为10 mg/kg 因药物的剂量-反应规律一般是当剂量呈对数级数增加时，反应呈算数级数增加，当用算术剂量为横坐标、反应为纵坐标绘图时，量效曲线呈长尾S型，而将剂量改为对数剂量（各剂量在横坐标上依次为等距离），量效曲线呈对呈的S型，在反应为20-80%的范围内，基本为直线。直线化后的量效曲线可进行简单的直线回归，求出相关系数r及回归方程，进而计算出ED50等。药效试验最理想的剂量范围是ED20-ED80之间。,
