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1、薄层色谱分离菠菜叶中的色素,一、实验目的,1.学习色谱法的原理和方法。 2.学习薄层色谱法进行定性分析的原理。 3.学习并掌握薄层色谱法的操作技术。 4. 练习植物中色素提取的基本思路和方法。,二、实验原理,色谱法最初是由俄国植物学家茨维特在1906研究用碳酸钙在玻璃柱中分离植物色素时发现，色谱法（Chromatography)因之得名。色谱法发展到今天，已有柱色谱、薄层色谱、纸色谱、液相色谱、气相色谱等多种形式。 色谱法又称层析法、色层法，是分离、提纯和鉴别有机化合物的重要方法之一。色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能 (即分配)的不同，使混合物的各组分流经该种物质
2、，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。 这一方法在化学化工、生物学、医学中得到了普遍应用。,三、实验用品,1.仪器：展开缸 、分液漏斗、 研钵、玻璃板 (3cm1Ocm)、锥形瓶(50mL)、量筒 (10mL)、点样用毛细管，烧杯（100mL）2.试剂：硅胶G、石油醚 (60-90)、饱和NaCl溶液、C2H5OH、C6H6、CH3COCH3、无水Na2SO4,四、实验步骤,1.薄层板的制备 (1)制备薄层载片 将玻璃板要用洗衣粉和水洗涤，再用水淋洗，然后用50%甲醇溶液淋洗，让片完全干燥，取用时应让手指接触玻璃片的边缘，因为指印沾污片的表面上将使吸附剂难于铺在片上。,(2)制备浆料
3、,不同吸附剂所用溶剂量有所不同：一般1g硅胶G需要0.5%CMC清液3-4mL或约3mL氯仿或水；1g氧化铝需要0.5%CMC清液约2mL； 本实验用蒸馏水为溶剂,要求：制成的浆料要求要均匀，不带团块，粘稠适当。 方法：应将吸附剂慢慢地加至溶剂中，边加边搅拌，最好用广口瓶，旋紧盖子，将瓶剧烈摇动，保证充分混和；或用磁力搅拌器搅拌；或用匀浆机匀浆；或用研钵研匀,(3)铺板要求：薄层板制备的好坏是薄层色谱法成败的关键，为此，薄层必须尽量均匀且厚度 (0.25-1mm)要固定。,方法：,平铺法,倾注法,浸涂法,固化: 将铺好的薄层板放在己校正平面的平板上晾干。,活化： 将干透的薄层板置于烘箱中加热活
4、化。活化时需慢慢升温，硅胶在约110左右活化30-60分钟可得-级活性的薄层板。,2.配制展开剂将 苯:丙酮:石油醚按2 : 1 : 2V/V混合共20mL倒入干净且干燥的层析缸中，盖好盖子，备用。一般展开剂要配好后饱和15-30min后才可使用。,四、实验步骤,3. 叶绿素的提取,在研钵中放人几片 （约5g）菠菜叶 (新鲜的或冷冻的都可以，如果是冷冻的。解冻后包在纸中轻压吸去水分)，加入1OmL2:1的石油醚和乙醇混合液，适当研磨 (不要研成糊状，否则会给分离造成困难)。,将提取液用滴管转移至小分液漏斗中，加入10mL饱和NaCl溶液 (防止生成乳浊液)除去水溶性物质，分去水层；再用蒸馏水洗
5、涤两次；将有机层转入干燥的小锥形瓶中，加2g无水Na2SO4干燥；干燥后的液体倾至另一锥形瓶中。,四、实验步骤,4.点样,在距薄层一端8-10mm处，划一条线，做为起点线。用毛细管 (内径小于1mm)吸取样品溶液垂直地轻轻接触到薄层的起点线上。如溶液太稀，一次点样不够，第一次点样干后，再点第二次，第三次。多次点样时，每次点样都应点在同一圆心上，点的次数依样品溶液浓度而定，一般为2-5次，若样品量太少时，有的成分不易显出；若量太多时易造成斑点过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离。点样后的斑点直径一般为1-2mm为圆点。若为多处点样时，则点样间距为1-1.5cm。,5.展开,当展开剂上升到薄层
6、的前沿 (离顶端5-10mm)或各组分已明显分开时，取出薄层板用铅笔或小针划出前沿的位置即终点线，放平晾干，之后即显色，如果为无色物质，需喷显色剂显色。,薄层的展开需在密闭的容器中进行。 将点好样的薄层板放人色谱器中进行展开。 点样的位置必须在展开剂液面之上,起点线,6.计算比移值,显色后，记下各斑点中心位置，通常用比移值Rf表示物质移动的相对距离。,影响Rf值的因素：分析方法（薄层色谱、纸色谱）；固定相的种类，流动相的种类（展开剂）；温度；物质的分子结构等。根据Rf值的不同对各组分进行鉴定，因此色谱法可以用于物质的鉴定、分离、纯化。,7.结果（计算各色素的比移值）,起点线,脱镁叶绿素,叶绿素b,叶黄素,叶绿素a,胡萝卜素,
