蛋白酶的盐析沉淀实验报告

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1、蛋白酶的盐析沉淀实验报告蛋白酶的盐析沉淀实验报告 班级：生工班级：生工 1005 学号：学号：0203100520 姓名：朱同辉姓名：朱同辉 实验目的：实验目的： 1.掌握使蛋白质胶体溶液保持稳定的因素； 2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义； 3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法； 4.学习酶活力的计算方法。 实验原理：实验原理： 盐析法盐析法 在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达 一定浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。 原理 ： 大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去除水膜； 大量盐能中和蛋白质分子表面电荷，使分子间静电斥力减弱，疏水作用增强，使蛋白 质

2、沉淀。 盐析效果： 二价离子 一价离子 离子半径小 离子半径大 阳离子Mg2+Ca2+Ba2+NH4+Na+K+Pb+Cs+ 阴离子PO43-SO42-Cl-Br-NO3-I-SCN- 蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用 Cohn 经验式来表示： 式中：S蛋白质的溶解度 I离子强度 常数，与温度和 pH 有关 Ks盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关 其中 I 根据下式计算： 式中：cii 离子的浓度（mol/L） zii 离子所带的电荷 蛋白酶活力的测定蛋白酶活力的测定 福林（Folin）试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪蛋白产生 酪氨酸，将产物中未被水解的酪蛋白除去

3、后与福林试剂作用，根据显兰色的深浅可以计算出 酪氨酸的产生量，从而推断酶活力的大小。 蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算 IKSlog s 2 iiz c 2 1 I K在酪氨酸标准曲线上 O.D 值为 l 时酪氨酸的微克数（g） ，K 值为 108.53 N酶液稀释倍数 4酶反应液为 4 ml，取出 1 ml 测定，故乘以 4 10反应时间为 10 min 参考稀释倍数：原酶、饱和度 20%，30%，40%，50%，60%，70%的上清液分别 为 1000，200，150，100，100，100，50 倍 实验步骤：实验步骤： 1）蛋白质盐析）蛋白质盐析 分两个大组

4、进行实验，每大组取 6 只烧杯编号，分别加入 50 ml 蛋白酶液，分别称量 5.70，8.80，12.16，15.66，19.5 和 23.6 固体硫酸铵粉末（对应 20%，30%，40%，50%，60%，70%饱和 度） ，在磁力搅拌器不断搅拌下，将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌 5 min，使硫酸铵完全溶解。然后 静置使蛋白酶沉淀完全。 将含有沉淀的酶液小心倒入离心管中，在天平上称重平衡，用高速冷冻离心机离心于 10，10,000 r/min 离心 20 min。 将上层清液倒入量筒记录其体积，并分别测定酶活（u/ml） ，即为该酶的溶解度 S。 2）蛋白酶活力的测定：）蛋白酶活力的测定

5、： 1.将 2%酪蛋白溶液 40预热 3-5min 2. 取 3 支试管编号 0、1、2，分别吸取待测酶液 1ml 放入试管中，40水浴中预热 1-2min 3.往 0 号试管加入 0.4mol/L 三氯醋酸 2ml，再往 3 支试管中加入 2%酪蛋白 1ml，计时摇匀，40反 应 10min 4.往 1、2 号试管中加入 0.4mol/L 三氯醋酸 2ml，摇匀，取出 3 支试管静置 10min 5. 另取 3 支试管，分别吸取上述清液 1ml，各加入 0.4mol/L 碳酸钠溶液 5ml，福林试剂 1ml，于 40水浴中保温 20min 显色。 6.以 0 号管为对照，在波长 680nm

6、处测定 1、2 号管的吸光度，求出平均值。 3）蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算）蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算 计算出各种硫酸铵饱和度下的硫酸铵浓度，离子强度，蛋白酶溶解度和上清液酶活残留，并填表。 以 log S 为纵坐标，I 为横坐标作图，将直线部分线性回归，求出 Ks 和 的数值，建立起蛋白酶的 盐析曲线。 数据记录及实验结果：数据记录及实验结果： 680 D.ONK 10 4 力力力 编号O.D680平均值上清液体积/mL 10.388 原酶液 20.424 0.406 11.069 饱和度 20% 21.173 1.12155.8 10.819 饱和度 30% 20.823 0.82

7、155.4 10.952 饱和度 40% 21.018 0.98553.0 10.021 饱和度 50% 20.418 0.22056.2 10.062 饱和度 60% 20.040 0.05158.5 10.091 饱和度 70% 20.211 0.15162.1 编号(NH4)2SO4浓度 mol/L离子强度 I上清液酶活蛋白酶溶解度 SlogS 原酶液00 饱和度 20%0.822.464866271522.85.43 饱和度 30%1.233.697128394891.25.59 饱和度 40%1.644.926414339942.05.53 饱和度 50%2.056.1595553671.04.72 饱和度 60%2.467.3822112928.54.11 饱和度 70%2.878.6132820368.84.31 讨论：讨论： 通过本次试验，初步掌握了蛋白酶盐析沉淀及其酶活测定的方法。在开始实验时，对 实验的整体思路没有理解，仅仅盲目的按照步骤进行，导致浪费了很多时间，并且实验结果 不理想。希望老师能在实验的前一周把讲义发给大家，进行充分的预习，对提高实验效率和 准确度会有帮助。