《天然DNA的制备》由会员分享，可在线阅读，更多相关《天然DNA的制备（37页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、基因工程 （Genetic Engineering）,田长恩Tel: 13342886615,基因工程,1 基因工程概论,2 天然DNA的制备,3 分子克隆工具酶,4 分子克隆载体,5 表达载体,6 PCR技术及其应用,7 基因文库的构建,8 基因克隆的筛选策略,10 细菌基因工程,11 酵母基因工程,12 植物基因工程,13动物基因工程,14 基因工程的安全,9 转基因及其表达,2 天然DNA的制备,2.1 核酸与克隆有关的重要结构与性质,体外DNA重组是基因工程的基本内容和关键技术，DNA则是基因工程操作的主要对象；RNA可被反转录成cDNA进行操作。,2.1.1 DNA的组成、结构、复制
2、和重要特性2.1.1.1 DNA(RNA)的组成,脱氧核糖核苷酸,A,T,G,C,(OH),U,RNA,DNA双链, (OH), (OH), (OH), (OH), (OH),链间氢键,2.1.1.2 DNA的空间结构,B-DNA双螺旋 结构模型,双螺旋构象,茎环与发夹,tRNA二级结构 三叶草,tRNA 三级结构,rRNA,核糖体,DNA超螺旋,核小体,核小体,mRNA功能（遗传密码),密码子简并 通用 连续,线粒体密码子,tRNA功能转运氨基酸,遗传信息的传递与表达,2.1.1.3 DNA的半保留复制复制起点: 富含AT，其侧面是富含GC的回文结构。复制子：从起点开始复制出一个DNA分子或
3、片段的序列。包括单、多复制子。复制必须因子：DNA聚合酶、底物（dNTP）、寡聚核苷酸引物、模板等。,旧链 新链 新链 旧链,2.1.1.4 DNA分子的重要特性1）变性：在一定的条件下，DNA双链因链间氢键破坏而解链的过程。如温度变性，90足以使所有的DNA变性；其他, 如pH、离子强度、脱水剂等。2）复性：变性DNA分子因链间氢键恢复而重新形成双链DNA的过程。若是温度变性，当缓慢降低温度时，该过程得以进行。以上是PCR反应的依据。3）带电性：一般pH下，带负电荷，可电泳分离。4）水溶解性：DNA属于生物大分子，且带电荷，通常分子外形成水膜，可溶于水；但当电荷变化（如等电点）或水膜破坏时，
4、就会沉淀，这是DNA提取和分离的依据。,2.1.2 基因的结构和遗传密码2.1.2.1 原核生物基因的结构,2.1.2.2 真核生物基因的结构,2.2 天然DNA的制备2.2.1 天然DNA的来源和用途1）染色体DNA：用于分离目的基因或基因表达调控因子（promoter, enhancer）、提供构建染色体载体和染色体基因整合平台。2）病毒和噬菌体DNA：编码结构基因；可用于克隆启动子，如CaMV 35S 启动子；主要用于构建基因克隆载体，最大优点是可以体外包装，如CaMV、SV40、M13、T4、T7、-174。3）质粒DNA：微生物中存在的游离于核外的DNA，因具有复制起点，能自我复制，
5、1103 kb。主要用于构建基因克隆载体，如大肠杆菌、农杆菌和蓝细菌等的质粒；少数含有结构基因。4）细胞器DNA：主要有线粒体和叶绿体DNA，用于分离目的基因或基因表达调控因子，也可于构建克隆载体。,2.2.2 天然DNA的提取2.2.2.1 原理1）生物材料的准备使材料处于提取DNA得率最高的时期，选取最容易提取和含量最高的组织。如细菌培养至对数生长期后期；植物材料用幼嫩植株，且暗培养12天或黄化苗；动物以 肝脏为好，须将胆囊除尽。2）细胞的裂解裂解不够，DNA得率低；裂解过猛，DNA断裂。细菌可用溶菌酶、NaOH + SDS、煮沸、冰冻或超声波等方法处理。动植物组织，先粉碎材料，再裂解细胞
6、。3）DNA的分离和抽提根据待提DNA的性质，将其与其他组分分离，进一步抽提DNA。一般先按1:1（V:V）用酚、酚+氯仿、氯仿对裂解液分别进行抽提，以除去蛋白质，然后按2:1用乙醇（V:V）或,1:1用异丙醇（V:V）在酸性条件下（加1/10 体积的 3M NaAc pH4.8）沉淀DNA。 注意：提取细胞器、病毒或噬菌体DNA时，必须先从裂解液中分离出完整的细胞器、病毒或噬菌体，并用DNase处理附着在其表面的其他DNA。提取质粒DNA时，先调节裂解液的pH值到12.6，使所有 DNA沉淀，再调节pH值到中性，使质粒DNA复性从沉淀中释放出来。用RNase水解除去RNA。2.2.2.2 实
7、例1）质粒DNA （实验）2）噬菌体DNA （自学）3）植物基因组DNA （实验）4）动物基因组DNA（自查资料学习）,2.3 DNA的纯化1）氯化铯溴化乙锭连续梯度离心法纯化剂量大、纯度高的DNA，须有超速离心机、氯化铯（昂贵），时间长。操作步骤如下： DNA 样品预处理：DNA溶液置离心管，每毫升加1g固体氯化铯， 30下缓慢溶解，再加溴化乙锭（EtBr或EB）溶液（ 10 mgml）至终浓度 0.7 mgml。溶液中氯化铯终浓度为 1.55 gml，折射率为 1.3860。超离心：室温下8000 rmin离心5 min，吸取液面浮渣下的清液置于一塑料离心管中，用液体石蜡盖在液面上， 20
8、下以45000 r/min 离心3640 h。收集DNA：紫外灯下观察DNA带。在DNA带下方用21号针头刺穿离心管壁收集DNA。,除EB：在收集液中加等体积正丁醇（水饱和），混匀，离心 (1500 rmin) 3 min，取水相。如此处理 46次，直至水相液体在紫外灯下无橘红色。 除氯化铯: 透析法。2) 离子交换层析法原理：DNA磷酸基团与固相材料上的离子相互作用，结合于层析柱固体介质，用浓度梯度盐溶液可将结合的离子洗脱。三烃甲基氯化铵层析树脂法: DNA在低盐浓度（0.1 0.5 mmolL NaCl）下与树脂结合，且双链 会比单链 结合牢，分子大的比小的结合牢，线形比环状分子结合牢。因
9、此，当层析柱平衡后，可用 0.52.0 mmolL的梯度浓度NaCl溶液洗脱DNA，分部收集洗脱液，经核酸紫外检测仪,检测，确定含有待纯化DNA的洗脱液，再经透析除去NaCl，获得纯的DNA。羟基磷灰石法：低盐浓度溶液中，DNA和RNA的磷酸基团通过与羟基磷灰石的钙离子相互作用而结合，随后用浓度梯度磷酸盐溶液洗脱和回收DNA或RNA。单链DNA(或RNA)的磷酸基团比双链少，结合的牢固度低于双链，洗脱时先被洗脱。于是，可分部洗脱单链DNA（或RNA）和双链DNA。用核酸紫外检测仪确定待纯化 DNA的洗脱液，再经透析除去磷酸盐。3) 琼脂糖凝胶电泳洗脱法此法适用于小剂量DNA的纯化和酶切DNA片
10、段的回收。 DNA样品 电泳 切胶 装(透析)袋或框 加稀释电泳缓冲液(1/10 l/2), 稀释缓冲液电泳 12 h 反向电泳3060 Sec 洗脱液置离心管 离心 转上清入新管 乙醇沉淀 离心 晾干 溶于TE,（TE: 10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA）。4) 从DNA样品中去掉EB经凝胶电泳回收和氯化铯浓度梯度高心制备的DNA样品，含有EB，影响酶切，因此，须去掉插入DNA中的EB。 可以用正丁醇（或异戊醇）抽提等方法。正丁醇（或异戊醇）抽提法：加等体积正丁醇(用溶解 DNA的缓冲液饱和)入DNA样品溶液，轻轻混合，待上下相液体分开后，弃去上
11、相正丁醇。重复以上步骤至少一次，至上相正丁醇无桔红色。,2.4 DNA(RNA)的浓缩乙醇沉淀法：在样品中加1/10 体积的NaAc、2倍体积的无水乙醇，冰上10 min 以上，4 下离心(12 000 g)10 min，去上清，70% 乙醇（4 ）洗涤，去乙醇，干燥后溶入TE，20 (RNA于80 )保存。此法沉盐，影响酶切。 异丙醇沉淀法：在样品中加1倍体积的异丙醇，冰上10 min 以上，4 下离心(12 000 g以上)10 min，干燥后溶入TE，20 (RNA于80 )保存。此法不沉盐。,正丁醇抽提法：向DNA溶液中加入1倍体积的正丁醇，充分混匀，以1600 r/min离心l min，弃上相液体。如此重复至液体达到所需要的体积。然后用水饱和的乙醚抽提DNA溶液两次，去除正丁醇。最后在空气中蒸发乙醚。 聚乙二醇浓缩法：将DNA溶液装人透析袋，置于高浓度的聚乙二醇(PEG600)溶液中，4 下使DNA溶液浓缩至所需要的体积,1 名词解释DNA变性；DNA复性；Tm值 2 简要回答下列问题1） 举例说明浓缩DNA或RNA的方法。 2） 简述DNA与基因工程有关的主要特性。3） 简要说明天然DNA的主要提取过程。,复习思考题,
