植酸酶的分子生物学与基因工程

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1、植酸酶的分子生物学与基物因工程,组员：张亚丽耿红汭黄银霞,植酶酸的分子生物学和基因工程,植酶酸植酸酶介绍、用途、研究意义 植酶酸的分子生物学1、微生物来源的植酸酶的酶学性质2、植酸酶基因3、植酸酶的高级结构 植酶酸的基因工程1、在微生物中高效表达植酸酶基因2、植酸酶的植物基因工程3、植酸酶的热稳定性,植酶酸,植酶酸分子结构,植酸酶,植酸酶是一种能水解植酸的磷酸酶类。它能将植酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌醇和无机磷酸。,植酸酶,此酶分为两类：3植酸酶(EC3 1 3 8)和6一植酸酶(EC 3 1 26)。植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中如玉米、小麦等高等植物，枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌

2、、大肠杆菌等原核微生物及酵母、根霉、曲霉等真核微生物中。,植酸酶,植酸酶是一种能将饲料中植酸磷水解成无机磷和肌醇新型单胃动物饲料添加剂。,植酸酶,植酸酶可作为一种单胃动物的饲料添加剂，它的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60，粪便中磷排泄量减少40，同时还可降低植酸的抗营养作用。因此在饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。,植酸酶,植酸酶作为一种能将饲料中植酸磷水解成无机磷和肌醇的新型单胃动物饲料添加剂，主要应用于猪、鸡、鸭等单胃动物和水产养殖动物，应用范围广，需求量大。,植酸酶,它在欧洲使用较为广泛，在我国目前还没有商品化的

3、植酸酶生产，但是，考虑到我国的国情，植酸酶在我国的推广使用有着极为重要的意义。,植酸酶 植酸酶在我国的推广使用所具有的重要意义 ：,植酸酶的使用能减轻江河、水域环境的磷污染。我国江河、水域的富营养化污染极为严重如滇池的严重污染、近期发生的红潮等。造成污染的关键因子是水体中的氮和磷过量。我国每年从畜禽粪便中排出的磷就达250万t之多，是水体富营养化污染的罪魁祸首之一 。,植酸酶,形成高磷粪便的原因是饲料中的磷没有得到有效利用。植酶酸的使用将使畜禽粪便中的磷排出量减少4075即我国将大大减轻江海、水域等环境的磷污染。,植酸酶,植酸酶能缓解我国磷资源匮乏、磷供应不足的局面。我国是一个缺磷大国，磷的产

4、量不足需求量的十分之一，是仅亚于蛋白质的第二大缺口饲料原料。,植酸酶,植酸酶的使用可代替饲料原料中所添加的无机磷(磷酸氢钙)，全国每年少用磷酸氢钙80120万吨，从而可关停相应一批污染重的磷酸氢钙生产厂，这对我国这种严重缺磷的国家而言有着更为重要的社会效益和生态效益。,植酸酶,植酸酶到目前为止并没有得到广泛的推广应用 。,植酸酶 主要原因是：,植酸酶在天然材料中的含量太低，难以大量生产，生产成本昂贵 植酸酶的抗逆性，尤其是热稳定性不能完全满足饲料及饲料加工的要求,植酸酶,随着基因工程技术的发展为这些问题的解决提供了一条有效的新途径，植酸酶的基因工程研究已成为世界性的研究热点。,植酸酶的分子生物

5、学,在1907年Suzuki等就在谷糠中发现了具有植酸酶活性的磷酸酶，接下来的较长的一个时期中研究都集中在植物和动物器官中的植酸酶第一个纯化的植酸酶来源于麸皮，研究发现它虽然具有植酸酶活性但植酸并不是它的特异性底物。,植酸酶的分子生物学,来源于植物的植酸酶均属于6-植酸酶最适pH范围在5.07.5，不适合在单胃畜禽酸性的胃中起作用而且在植物中含量极低，因而从应用的角度出发60年代末植酸酶的研究转向最适pH值为酸性、酶含量较高的微生物来源的植酸酶。,植酸酶的分子生物学 微生物来源的植酸酶的酶学性质,许多微生物都能产生植酸酶尤其在曲霉屑中。1968年Shieh等“发现所用的22株黑曲霉菌中有21株

6、能产生植酸酶。第一个被分离纯化的植酸酶来源于Aspergitlusterreus No9A一1，它的最适pH值为4.5，最适酶反应温度为70，此酶在pH 1.29.0均能稳定维持其活性。,植酸酶的分子生物学 微生物来源的植酸酶的酶学性质,从此以后陆续从十几种微生物中分离到植酸酶，如枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、酵母、曲霉等，并对酶的生理生化性质进行了较深入的研究。其中来源与 Aficuum NRRL3135(A.niger var awamori)的植酸酶PHYA具有较好的耐热性，在酸性条件下有较高的酶活性，被认为是目前最具有应用前景的饲用植酸酶，其酶学性质研究也较为深入。,植

7、酸酶的分子生物学 微生物来源的植酸酶的酶学性质,这种来源的植酸酶PHYA属于3一植酸酶是一种檐基化蛋白，糖基化含量为273，糖链中富含甘露糖，表观分子量约为85kD。它的最适pH值为2.5和5.5、最适温度为55，在37、pH2.5的条件下以植酸钠为底物的Km值为50mmolCa2+、Fe2+对酶活性无影响，Mn2+、Co2+有激活作用，能使酶活性分别提高30和13,植酸酶的分子生物学 微生物来源的植酸酶的酶学性质,Cu2+、Zn2+、Fe2+和Cu+对酶活性有抑制作用，其中前两种为非竞争性竞争，后两种为竞争性抑制。另外，对一些来源于动物、植物的酸性磷酸酶有抑制作用的抑制剂如磷霉素对它却没有抑

8、制作用。,植酸酶的分子生物学 微生物来源的植酸酶的酶学性质,它对植酸酶有很高的底物特异性，酶的特异比活性为105 105 umg酶蛋白，是目前发现的比活性最高的植酸酶之一，它降解植酸磷形成的终产物是单磷酸肌醇和无机正磷酸。,植酸酶的分子生物学 微生物来源的植酸酶的酶学性质,来源于A .niger 963植酸酶PHYA酶学性质与来源于A.ficuum NRRI 3135(Aniger var awamori)的植酸酶PHYA基本相似，仅在最适pH上有所差异 前者最适pH值为1.8和5.7。来源于大肠杆菌的植酸酶的分子量为43kD，最适pH值为3.5，特异性活性为750 umg。,植酸酶的分子生物

9、学 微生物来源的植酸酶的酶学性质,来源于枯草芽孢杆菌的植酸酶的分子量为43kD，最适PH值为7.0。目前发现的绝大部分微生物来源的植酸酶分解植酸盐形成的终产物均是单磷酸肌醇和无机正磷盐，但1998年Mcchlzuki等从西方许旺酵母中分离出的植酸酶可将植酸盐分解为肌醇和无机磷酸。,植酸酶的分子生物学 微生物来源的植酸酶的酶学性质,另外一些微生物来源的酸性磷酸酶虽然最适底物不是植酸盐，但也具有部分植酸酶的活性，如来源于黑曲霉 的最适PH2.5的酸性磷酸酶，来源于大肠杆菌的最适PH2.5的磷酸酶。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,到目前为止，共有十余个植酸酶编码基因得到了分离克隆。几乎所有分离得到

10、的植酸酶基因都申请了专利。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,最先分离出的植酸酶基因是Aspergillus ficuum NRRL 3135的phyA基因。该结构基因全长1506bp，其中+46+147的102bp的核苷酸序列是一典型的真菌内含子序列，其上有真菌内含子的特征保守序列：Donor序列GTATGC、Lariat序列GCTGAC及Acceptor序列CAG。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,它的基因编码467个氨基酸，根据信号肽序列结构规则推断，N端的19个氨基酸为信号肽，信号的肽切割位点在+19位的Gly之后。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,来源于Aspergillus ficu

11、um NRRL3135的植酸酶是一种糖基化蛋白，在phyA编码的氨基酸序列上，发现了10个潜在的N一糖基化位点(AsnXSerThr，x为任意氯基酸)。从氨基酸推断出的理论分子量约为51.4kD，糖基化后的表观分子量在85 kD左右。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,氨基酸序列上存在组氨酸酸性磷酸酶的活性位点保守序列（Active-site sequence）：CQVTFAQVL_SRHGARYPTDSKGK，它位于氨基酸序列的+52+74，可归为组氨酸酸性磷酸酶这一家族。Aspergillus ficuum NR-RL3135的phyA基因中G+C百分含量达到68.3，这是丝状真菌中高表达蛋

12、白编码序列所特有的特征之一。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,来源于丝状真菌，尤其是曲霉的phyA基因无论在核苷酸来源、编码的氨基酸序列等基因结构上，还是在基因产物的酶学特征上均具有较高的相似性,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,例如他们的编码基因长度相当，核苷酸同源性较高，编码的氨基酸个数都在460480之间，氨基酸序列上也有较高同源性，均具有活性位点保守序列RHGxRxP，在氨基酸序列上有数量不等的潜在糖基化位点，翻译后的蛋白都需要糖基化修饰后才具有正常的生物学活性。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,phyB基因与phyA相比，虽然也属于组氨酸酸性磷酸酶家族，有活性位点保守序列RHGxRxP

13、，但核苷酸序列及编码的氨基酸序列同源性较低，实际上它的最适底物不是植酸盐，它仅是具有植酸酶活性的酸性磷酸酶。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,来源于细菌的植酸酶也是另一类植酸酶，它的编码基因较短，编码蛋白的分子量也小，它的核苷酸序列及编码的核苷酸序列与phyA和phyB及已报道的磷酸酶基因没有同源性，它也没有普遍存在于phyA和phyB编码蛋白上的活性位点保守序列RHGxRxP，这说明它不属于组氨酸酸性磷酸酶家族。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,对这一类植酸酶研究仅在近年来才开始涉及, 1998 年 Ker ovuo等才首次从 Bacillus s ubtilis 中分离出其完整的编码基因。

14、来源于 Bacillus s ubtilis 的植酸酶基因 phyC 全长 1152,编码 383个氨基酸,其中 N 端的26 个氨基酸是信号肽序列。生物学活性依赖钙离子的存在。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,目前唯一报道的植物来源的植酸酶基因是 Maugenset等 于 1998 年从萌发的玉米种子中分离的,成熟酶由两个相同的亚基组成, 亚基的结构基因( CDNA) 全长 1167bp, 编码 387 个氨基酸, 理论分子量为 41kD。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,它与微生物来源的植酸酶没有氨基酸序列同源性, 但存在一个包含活性位点保守序列 RHGxRxP 的 33 个氨基酸的同源区

15、, 与来源于 Aspergillus f icuum NRRL3135 的 phyA 和 phyB 相比, 这一段氨基酸序列的同源性分别达到 48%和 51%。,植酸酶的分子生物学 植酸酶基因,丝状真菌来源的 p hyA 基因编码的植酸酶,其 RHGxRxP 序列一般位于 N端,如 A sp er gillus f icuum NRRL3135 的 p hyA 中它的位置在+ 81 + 87, 而玉米植酸酶中, RHGxRxP 序列位置较靠后,在+ 204 + 210 的区域上。,植酸酶的分子生物学 植酸酶的高级结构,对植酸酶的高级结构研究较多的是来源于 Asp er gillusf icuu

16、m NRRL3135 的 phyA 编码的植酸酶 PHYA, Kostrewa等利用 X 衍射分析了它的晶体结构。,植酸酶的分子生物学 植酸酶的高级结构,PHYA 的高级结构中有 5 对二硫键: Cys8-Cys17、Cys48-Cys391、 Cys192-Cys442、Cys241-Cys295、 Cys413-Cys421, 用盐酸胍变性处理后, 植酸酶活性丧失,说明二硫键在植酸酶的折叠上扮演着重要的作用。,植酸酶的分子生物学 植酸酶的高级结构,PHYA 的晶体结构可分为两部分: 一个大的结构域和一个较小的结构域,结构域的中心是一个由 6 片组成的折叠片。,植酸酶的分子生物学 植酸酶的高级结构,PHYA 的晶体结构在两个结构域的内表面有一很深的凹套, 凹套中有酶催化活性的必需氨基酸 Arg58 和 His59, 它们是植酸酶活性位点保守序列 RHGxRxP 中的前两个氨基酸,在以前的研究中利用化学修饰的方法就已证实RHGxRxP 序列中的 Arg 58与鼠的低分子量酸性磷酸酶的晶体结构有很高的结构相似性, 说明它属于组氨酸酸性磷酸酶家族 。,