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1、DNA分子标记的种类以及进展,分子标记的定义,广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。 狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。,理想分子标记的界定,(1)具有高的多态性 (2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂台和纯台基因型 (3)能明确辨别等位基因； (4)遍布整个基因组； (5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组； (6)选择中性(即无基因多效性)； (7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)； (8)开发成本和使用成本尽量低廉； (9)在实验室内和实验空间重复性好(便于数据交换)。,
2、但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满 足以上所有要求,DNA分子标记分类,一、第一代分子标记技术以southern杂交为核心的分子标记技术：RELP标记等 二、第二代分子标记技术基于PCR的DNA分子标记：RAPD标记、ISSR标记、SSR标记、STS标记等基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记：AFLP标记、CAPS标记等 三、第三代分子标记技术基于单核苷酸多态性的DNA分子标记:SNP标记 四、其他几种新型分子标记,一、第一代分子标记技术,限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism，缩写RFLP)是发展最早的分子标记技术。R
3、FLP技术的原理是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插人和缺失造成酶切位点问的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。,流程图,酶切电泳标记探针杂交分析,一般选择单拷贝探针,如果RFLP探针是来自拷贝数可变串联重复(Varible number of tandem repeats，缩VNTR)则产生另一类因相同或相近序列的拷贝数变化所起的多态性。凡是引起复单位的大小和序列不同、基因组中重复的数目和分布不同等均可导致这种多态性的产生。在RFLP技术中成为分子标记的重复序列包括：(
4、1)小卫星(minisatellite)序列：重复单位(motif)约有碱基l060个(也有16100个碱基一说)，在基因组中多次出现。(2)微卫星(microsatelite) 或简单重复序列 (simple sepuencerepeats，缩写SSR)：重复单位含有15碱基(也有28个碱基一说),二、第二代分子标记技术,1、 基于PCR的DNA分子标记随机引物PCR标记：RAPD标记、ISSR标、AP-PCR、DAF等特异引物PCR标记:SSR标记、STS标记、SCAR、SPAR、SSCAP、ddF等 2、基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段的多态
5、性：AFLP标记等对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段的多态性：CAPS标记等,1.1.1随机扩增多态性DNA(RAPD),该技术用一个(有时用两个)随机引物(一般810个碱基)非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。不需要DNA探针，用一个引物可扩增多个片段，技术简单，只需少量的DNA样本，成本较低，RAPD标记一般是显性遗传（极少数是共显性），但是RAPD分析中重复性不高，由于共迁移的存在，在不同个体中出现相同分子量的滞后，并不能保证这些个体拥有同一条(同源）的片段,实验步骤,PCR电泳分析,应用,RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱
6、。 1、品种鉴定、系谱分析：用于识别种群、家族、 种内或种间的遗传变异，为生物血缘关系或分类提供依据，还可以分析混合基因组样品等。 2、基因定位：例如定位了莴苣霜霉病抗性基因。,RAPD技术的发展和相近的分子标记种类,DAF(DNA amplification fingerprinting）：与RAPD技术不同的是，在DAF分析中，引物浓度更高，引物长度更短（一般58个碱基）只有两个温度循环，并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，DAF通常会产生非常复杂的带型。在DAF技术的基础上，又展出ASAP技术。 AP PCR(arbitrarily primed poymerase chain reaclio
7、n) ：在APPCR分析中，扩增分为三个部分，每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异；在第一个PCR循环中，引物浓度较高；引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物 MAAP(Multiple Arbitrary Punplicon Profiling)：这是CaetanoAnolle（1994）创造的一个词，想用来统称所有这些相关技术，但迄今为止这个词很少使用,1.1.2加锚微卫星寡核苷酸(Anchored mi cmsatellite oligonucleotides）,Zietkiewicz et a1(1994)对STMS技术进行了发展，他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物，对基因组节
8、段而不是重复序列本身进行扩增。 在SSR的5 端或3 端加上24个随机选择的核苷酸，这可引起特点位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR、ASSR或AMP-PCR。,1.1.3任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， APPCR）,在APPCR分析中，所使用的引物较长（1050 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序
9、列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的APPC R谱带，,但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50个引物能产生1250种不同指纹图谱。 APPCR方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系（或同类系）中的多态性。AP-PCR的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。,1.1.4 DNA扩增指
10、纹印迹 (DNA Amplification Fingerprinting，DAF),DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是，DAF分析中所使用的引物浓度更高，长度更短（一般为5一8 bp），因此它所提供的谱带信息比RAPD大得多，如当使用5个核苷酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10一100个DNA片段。PCR扩增产物是在凝胶上进行分离，通过银染即可产生非常复杂带型。,1.2.1 SSR（Simple sequence Repeats,简单重复序列）,SSR 分子标记由Lit t M ,等于1989 年创建的。简单重复序（SSR）也称微卫星DNA，其串联重复的核心序
11、列为1一6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即（CA) n和（TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。,SSR具有以下一些优点：（l）一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重
12、复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。,1.2.2特定序列位点（STS）,特定序列位点(sequence tagged site，缩写STS)是对由其特定引物序列所界定的一类标记的统称。利用特异PCR技术的最大优点是它产生的信息非常可靠，而不象RAPD、AFLP和利用随机探针产生的RFLP存在某种模糊性(如难以鉴别片段的来源) 这类分子标记主要包括以下几种分子标记。,STMS,STMS(Sequence tagged microsateUites)通常又称为SSR，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphis
13、rms） 。引物根据与微卫星重复序列两翼的特定短序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大，所以这是检测多态性的一种有效方法。其特点包括：一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；得到的结果复性很高,STMS的发展和相近的分子标记种类,(1)把与SSR互补的寡核苷酸作为多位点RFLP技术中的探针； (2)把与SSR互朴的寡核苷酸作为PCR引物(可单独作引物或与随机引物配合使用)，扩增的是基因组DNA 的特定片段，即MP PCR和RAMPs： (3)用标记的SSR探针与RAPD扩增片段杂交即RAMPO或称为RAHM 或RAMS； (4)用5 或3 端
14、加锚的SSR 作引物(如GGCA )，即ISSR。,DAMD (directed amplification of minisatellite region DNA),直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。,ISTR (inverse sequencetagged repeat,这种技术与SPAR 技术也相近，也所用的引物是在copia序列反向重复序列的基础上设计的，扩增的是copia序列之间的DNA序列。,IFLP (intron fragmemt length polymorphism),检测的对象是内含子的长度差异。,RAMPO (random amplified microsatell
15、ite polymorphism ),RAMPO的基本步骤是：先用一个单一的随机引物(即RAPD引物)对基因组DNA扩增，用电泳将扩增片段分开，然后，把凝胶转移到尼龙膜上，使之与一个带有放射性标记(或其它标记)的与SSR互补的寡核苷酸探针(如CA8和GA8 )杂交，放射自显影后可得到新的多态性类。,1.2.3 序列特异性扩增区 (Sequencecharacterized amplified regions SCAR),SCAR 标记是在RAPD技术的基础上发展起来的。其基本步骤是：先作RAPD分析，然后把目标RAP D片段(如与某目的基因连锁的R 片段)进行克隆和测序，根据原RAPD片段两末
16、端的序列设计特定引物(一般比RAPD 引物长，通常24个碱基)，再进行PCR特异扩增，这样就可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。这样的位点就称为SCAR。SCAR比RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性(原因是使用的引物长)，标记是共显性遗传的。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。,1.2.4 单引物扩增反应 (single primer amplification reaction SPAR ),SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用一个引物，但SPAR分析中所用的引物不是随机的，而是在SSR的基础上设计的，例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。扩增的是SSR之间的DNA序列。又称为MPPCR(microsatelliteprimed PCR)。分析其多态性。另外，还有一种与SPAR技术非常相似的标记技术，即ISTR (Inverse Sequencetagged Repeat）技术，ISTR所用的引物是在反向重复序列基础上设计的，PCR扩增的是反向重复序列之间的DNA序列。,
