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1、第八章 分子发光分析,M + 能量,M,M + 热量,M + 热量 + h ,10-7-10-9s荧光F,10-3-10s 磷光P,分子发光：基态分子吸收能量被激发，然后从不稳定的激发态返回基态并发射出光子的现象,发光分析的特点：,1) 灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1-3个数量级。,2) 发光参数多，可进行动力学分析。,3) 线性范围宽。,4) 选择性比吸收光谱法好。,5) 应用范围不及吸收光谱法广。,单重态基态，S0,S=+1/2-1/2=0,M=2S+1=1,激发单重态，Si,S=+1/2-1/2=0,M=2S+1=1,激发三重态，Ti,S=+1/2+1/2=1,M=2S+1=3,允许跃
2、迁,禁戒跃迁,1) 单、三重态电子自旋方向不同，且激发三重态能级较低；,2) 三重态的寿命更长。,1. 激发态,8.1 分子荧光法,8.1.1 荧光产生的机理,2. 去活化过程,失活过程,辐射失活,非辐射失活,分子间能量转移失活,荧光,磷光,振动驰豫,内转换,外转换,系间跨跃,处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括：,1) 振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR）,同一电子能级内，以热能量交换形式由高振动能级至相邻低振动能级间的跃迁。 振动驰豫时间：10-12s,2) 内转换（Internal Conversion，IC）,在相同
3、多重态的电子能级中，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。内转换时间：10-12s,3) 外转换（External Conversion，EC）,受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。,4) 系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC）,当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁的过程。,处于单重激发态的最低振动能层的分子，在1
4、0-9-10-7s的时间内发射光子回到基态各振动能层的过程。,5) 荧光发射,从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后，再经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-4-10s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。,6) 磷光发射,8.1.2 荧光光谱,1. 激发光谱,固定某一发射波长，测定该波长下的荧光发射强度随激发波长变化的光谱，即为荧光激发光谱。,2. 发射光谱,固定某一激发波长，测定荧光发射强度随发射波长变化的光谱，得到荧光发射光谱，又称荧光光谱。,4. 三维荧光光谱,以荧光强度、激发波长和发射波长为坐标绘制的荧光光谱图。,3. 同步荧光光谱,同时记录荧光物质的发射光谱和荧光光谱。
5、,8.1.3 荧光光谱的基本特征,荧光发射波长比激发波长更长，即产生Stokes位移。,(1) 斯托克位移,(2) 形状,荧光光谱形状与激发波长无关。,(3) 镜像对称,通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。,解释1：能层结构相似性,能层结构相似性荧光为第一电子激发单重态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。,吸收光谱是由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能层而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。,由于激发态和基态的振动能层分布具有相似性，因而呈镜像对称。,由于电子吸收跃迁速率极快（10-15s），此时核的相对位置可视为
6、不变。当两个能层间吸收跃迁的几率越大，其相反跃迁的几率也越大，即产生的光谱呈镜像对称。,解释2：位能曲线（Frank-Condon原理）,1. 产生并可观察到荧光的条件：,(1) 分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；,(2) 吸光后被激发的分子具有高的荧光量子产率。,凡是使kF增加，其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。,8.1.4 荧光的产率与分子结构的关系,通常，kF由分子结构决定（内因），其它参数则由化学环境和结构共同决定。,2. 荧光与分子结构的关系,2) 共轭效应,3) 刚性平面性结构,4) 取代基效应,给电子取代基使荧光强度增大。如-OH、-NH2取代；,共轭度越大，
7、发射波长红移，发光强度增加。,吸电子取代基则降低荧光强度。如RCO-、 -NO2取代；,在发光分子中引入重原子时磷光增强荧光减弱。,1) 跃迁类型： *、*n 跃迁荧光相率高；,(1) 溶剂效应,(2) 温度,(3) pH值,8.1.5 影响荧光强度的外因,a. 溶剂极性可增加或降低荧光强度； b. 与溶剂作用从而改变荧光物质结构来改变荧光强度。,温度增加，荧光强度下降,有机物质的结构在不同pH值发生变化，改变荧光强度,无机荧光物质的稳定性受pH值影响，荧光强度发生改变。,(5) 荧光猝灭,(4) 内滤光和自吸：均可使荧光强度下降,碰撞猝灭,静态猝灭,转入三重态的猝灭,自猝灭,电子转移猝灭,溶
8、液的荧光强度,即：荧光测定必须在稀溶液中才可用于定量。,8.1.6 荧光仪器,组成：激发光源、样品池、单色器、检测器。,1. 光源：氙灯、高压汞灯、激光,2. 样品池：低荧光、不吸收紫外光的石英矩形或方形池,3. 单色器：以光栅作为色散元件，两个单色器,4. 检测器：光电倍增管，并与激发光成直角。,氙灯：200-700nm，分子灯，连续光谱,高压汞灯：365、405、436nm，线状光谱,激光：单色性好，强度大，通常用Ar激光,激发单色器：选择激发波长；,发射单色器：分离出荧光发射波长。,特殊点：,(1) 有两个单色器，光源与检测器通常成直角,(2) 固定激发波长，扫描发射波长可得发射光谱,(
9、3) 固定发射波长，扫描激发波长可得激发光谱,荧光光度计组成示意图,8.1.7 荧光分析法及其应用,8.1.7.1 定量分析方法,1. 校准曲线法,2. 标准对照法：,3. 多组分混合物的荧光分析,(1) 如果两组分的荧光峰相互不干扰，可直接测定;,(2) 如果两组分的荧光峰相互干扰，但激发光谱有显著区别，可选用不同的激发光进行测定；,(3) 如果两组分的荧光峰和激发光谱相互干扰，可选两个波长，解联立方程；,8.1.7.2 应用,1. 无机化合物的分析,芳香族化合物：具有共轭的不饱和体系，直接荧光测定。,加入某种试剂将非荧光物质转化为荧光物质进行分析,2. 有机化合物的荧光测定,铍、铝、硼、镓
10、、硒、镁及某些稀土元素,荧光分析,氟、硫、铁、银、钴、镍等,荧光猝灭,脂肪族化合物：与某种有机试剂作用后生成能荧光的化合物，通过测定其荧光强度进行定量分析。,荧光分析的特点：,1) 灵敏度高：检出限比UV-Vis低2-4个数量级；,2) 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性；,3) 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。,5) 应用不广泛：,4) 线性范围宽,电子由第一激发单重态的最低振动能级，以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态回到基态时，发射磷光。,8.2 分子磷光法,8.2.1 磷光的产生和强度,T1S0
11、跃迁过程是自旋禁阻的，发光速率较慢，约为10-4-10s，因此，在停止激发光照射后，磷光仍持续一段时间。,荧光由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；,荧光与磷光的根本区别：,磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。,1. 磷光的特点,1) 磷光波长比荧光的长(T1CA时， CB 为常数，发光反应可视为一级反应,A + B,C* +D,发光物质,化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系，可用于定量分析,待测物质,发光总强度,8.3.3 化学发光反应的类型,1. 液相化学发光,研究和应用的比较广泛的有鲁米诺、光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。,鲁米诺是最常用
12、的发光试剂，可以测定Cl2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，化学发光反应的量子效率为0.010.05,鲁米诺在碱性溶液中和H2O2等氧化剂反应，生成最大波长为425 nm的光辐射,氧化剂,反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激状态，返回基态时发射荧光。可检测10-9 mol/LH2O2,425 nm,测定Co(),Cu(), Ni(), Cr() 等过渡金属离子.,应用,1) 鲁米诺H2O2的化学反应，可以被一些痕量的过渡金属元素所催化，使发出的光大大增强；,检测限由0.0140 gmL-1不等,2) 利用鲁米诺发光体系可以测定50余种元素和大量有机和无机化合物，灵敏度都比较高,
