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1、核酸分子杂交技术,杂交技术的原理,杂交：核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对原则形成稳定的杂合双链核酸分子的过程，称为杂交。 杂交的三种形式：DNA-DNA,DNA-RNA和RNA-RNA，其稳定性依次增大。 检测对象：提纯的核酸和细胞内的原位的核酸。 核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性。主要应用有：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定位、定性、定量检测、特定基因的时空表达模式和疾病的诊断等方面。,Whole mount in situ hybridizationSouthern and Northern blotting,原理,整体原位杂交（ Whole
2、 mount in situ hybridization ），是一种应用标记探针与经处理的胚胎中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。 特点：优点是可以显示、比较许多特定基因的分布情况，缺点是无法显示其相对量的情况，可能与蛋白表达位置不符，不能鉴定选择性剪切的产物，费时、一定的技术难度。 整体原位杂交已经成为基因表达定位和表达分布模式研究的一种重要手段。该技术能在整体水平上精确地研究胚胎发育过程中基因表达的三维信息。,Whole mount in situ hybridization,探针的分类： 核酸的性质: DNA探针RNA探针 是否使用放
3、射性标记物:放射性标记探针非放射性标记探针 (DIG、荧光素和生物素) 是否存在互补链:单链探针双链探针。 特点：单链探针较双链探针杂交时效率更高；RNA探针一般为单链, 具有单链DNA探针的优点, 另外RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。,体外转录法合成RNA探针,DIG标记的RNA探针。 许多载体如pBluescript, pGEM等均带有来自噬菌体的SP6、T7或T3的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别，合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经DIG标记的NTP，
4、则可合成RNA探针。,体外转录法合成RNA探针,探针制备,选择探针的原则 探针应对应着mRNA的特异区域 长度（200-1000 bp） 3-UTR? 与其它序列的同源性有较低或无同源性,1、模板的制备,方法一、制备质粒模板方法二、PCR法：在引物中引入启动子序列，聚合酶选用高保真、末端不加A的酶。,目的片段克隆到载体(pGEM-T Easy)将PCR产物与T Easy连接，连接是非定向的，需要测序确定连接的方式。,体外转录法合成RNA探针,A、质粒提取（彻底抽提蛋白，避免有机溶剂残留） B、酶切（酶切位点的选择原则）：使合成的探针长度在200bp-1000bp；切勿形成 3overhang；
5、尽量选常见的酶；分清编码链和模板链。 C、酶切产物的回收胶回收或沉降回收（回溶或洗脱时要用DEPC处理的水，切勿混入超过0.1M的EDTA）。,体外转录法合成RNA探针,5,3,mRNA synthesis direction,Double Strand DNA,体外转录合成反义探针的模板（原位杂交所用的探针）是DNA的编码链 体外转录合成正义探针（原位杂交中的阴性对照）的模板是DNA的模板链,A,B,如果插入方向如图A，则反义探针的合成，应用限制性内切酶在靠近T7启动子的位置将质粒线性化，然后用SP6 RNA聚合酶来合成探针,T7,Sp6,T7,Sp6,如果插入方向如图B，则反义探针的合成，
6、应用限制性内切酶在靠近SP6 启动子的位置将质粒线性化，然后用 T7 RNA聚合酶来合成探针,2、体外转录,混匀后37度2小时 加2ul DNase 1 (RNase-free)，37度15分钟，消化DNA模板 加入2ul EDTA（pH8.0）终止反应。,体外转录法合成RNA探针,3、探针纯化,A、用0.1倍体积4M LiCl，2.5倍体积无水乙醇沉淀RNA，再经75乙醇清洗RNA沉淀，回溶在DEPC处理的水中，加入RNA酶抑制剂，保存于-70度B、用mini quick spin RNA columns（Roche） 直接纯化。,体外转录法合成RNA探针,配制新鲜电泳缓冲液TAE和琼脂糖胶
7、，以降低RNA的降解速度。点DNA marker估计其分子量。,体外转录法合成RNA探针,4、探针检测,体外转录法合成RNA探针,5、探针效率测定,A、将探针稀释成不同的浓度，点1l于尼龙膜上，80度烘膜3h（或120度烘烤30min），固定探针； B、Washing buffer 洗膜2min，R/T； C、Blocking solution 封闭30min，R/T； D、Antibody solution 抗体30min，R/T； E、Detection buffer 孵育5min，R/T； F、NBT/BCIP显色。,体外转录法合成RNA探针,体外转录法合成RNA探针,探针制备中的关键问
8、题,1、RNase free 2、酶切位点的选择 3、质粒模板的质量,体外转录法合成RNA探针,Trouble shooting,1、无探针合成可能原因A RNase 污染B 酶切位点选择错误C 质粒质量不好D 模板中混有过多EDTA,体外转录法合成RNA探针,Trouble shooting,2、探针的分子量不对 原因：A 用DNA marker检测B 不是变性胶电泳C 酶切过程发生错误切割,体外转录法合成RNA探针,Trouble shooting,3、探针条带不单一 原因：A 模板未消化干净B 模板不单一,体外转录法合成RNA探针,实验方法,1、胚胎的固定和水化4%PFA固定胚胎，梯度脱
9、水后保存于-20度。将保存于70%乙醇的胚胎经70%乙醇-50%乙醇-30%乙醇-DEPC处理的水-PBST梯度水化。,Whole mount in situ hybridization,实验方法,2、胚胎的前处理 渗透处理：10ug/ml 蛋白酶K-TE缓冲液（pH8.0） 37度5min-15min；经2mg/ml的甘氨酸终止反应。 后固定4% PFA 室温固定1小时。 乙酰化处理(可选，降低静电效应，减少非特异性染色)在0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)-0.4%（v/v）乙酸酐中孵育10min。,Whole mount in situ hybridization,实验方法,3、杂交
10、 杂交液：50%甲酰胺，0.1mg/ml肝素，1SSC，1Denharts，0.1% Tween，5mM EDTA，0.25mg/ml 酵母tRNA。 杂交条件：50-60度，1220hr。,Whole mount in situ hybridization,实验方法,4、杂交后洗脱（温度和盐浓度）,Whole mount in situ hybridization,实验方法,4、杂交后洗脱-RNase 消化,Whole mount in situ hybridization,实验方法,5、抗DIG抗体孵育Blocking buffer 1hr； Antibody solution 1hr （
11、1：2000稀释）。,Whole mount in situ hybridization,实验方法,6、显色 Coloration buffer: 100mM NaCl; 50mM MgCl2; 100mM (Tris-HCl pH9.5); 0.1% Tween-20。 Detection buffer: 100mM NaCl, 100mM (Tris-HCl, pH 9.5） NBT/BCIP显色液(硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐): NBT 0.33mg/ml; BCIP 0.16mg/ml; 1mM 左旋咪唑, 暗处显色,Whole mount in situ hybr
12、idization,实验方法,照相记录结果,Whole mount in situ hybridization,Example of zebrafish fgf17b,Cao Y et al., Developmental Biology 271 (2004) 130143,Example of Amphioxus BMP signaling molecules,Yu et al., Nature 445 (2007) 613617,杂交中的关键问题,对照的设定 A、为了说明组织RNA的完整性，用管家基因探针或Poly d（T）探针做阳性对照。 B、为了说明探针和目的基因的结合是特异的，用正义
13、探针做阴性对照。,Whole mount in situ hybridization,杂交中的关键问题,胚胎的渗透处理： 信号VS胚胎完整性 需实验来摸索,Whole mount in situ hybridization,Trouble shooting,无信号： 1、胚胎固定不好，RNA降解； 2、渗透处理不够，探针没能充分进入胚胎； 3、杂交温度过高； 4、洗脱条件过于苛刻,Whole mount in situ hybridization,Trouble shooting,阴性对照有信号： 1、探针的特异性差； 2、杂交条件不够严谨； 3、洗脱条件不严谨。,Whole mount in
14、 situ hybridization,实验操作,PBST（PBS+0.1%Tween）洗 15min5次。 Coloration buffer 洗5min2 次 Detection buffer 洗5 min NBT/BCIP stock solution 20 ul稀释到1ml detection buffer中，至于暗处显色。 15分钟后可观察一下，如显色较慢，可间隔时间较长再观察，如显色较快，需经常观察。,实验注意事项,试剂和容器处理：DEPC（焦碳酸二乙酯）或180 需带口罩，手套，注意RNase-free 移除溶液时，应轻吸，以免损伤胚胎 加液时，应注意从侧面加入，以免直接冲击胚胎。,电子版上交mRNA在斑马鱼发育过程中的表达图式；根据实验结果，推测该基因在早期发育的可能功能思考：影响原位杂交成败的关键因子及原因； 如何保证探针的特异性 根据所给序列，确定基因的名字，并确定如何合成正义探针和反义探针（选哪个酶切，选哪个酶合成）,
