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1、免疫学检验与临床应用,2,免疫学检测是指：借助免疫学、细胞生物学、分子生物学等理论或方法，对免疫分子（抗原、抗体、补体、细胞因子等）和免疫细胞进行定性、定量检测。,概述,临床上、免疫学检测可用于疾病的诊断、病情监测和疗效评价等。,3,抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。,抗原抗体反应,一：慨念,二：抗原抗体反应的特点,1.特异性 2.可逆性 3.阶段性 4.比例性,4,（一）、 特异性（specificity）,特异性示意图,概念：一种抗原分子通常只能与其刺激机体后产生的抗体结合，这种抗原与抗体结合反应的专一性称为特异性。,5,决定因素：由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空
2、间结构的互补性决定的,应用：由于抗原抗体反应具有高度特异性，故可用已知的抗原（抗体）来检测相应未知的抗体（或抗原）。,6,概念：两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应。,抗原抗体交叉反应示意图,B,交叉反应,7,（二）、比例性（proportionality）,1、比例性是指抗原与抗体发生可见反应遵循一定的量比关系。,2、以絮状沉淀实验为例，受抗原抗体比例性的影响非常明显。,3、根据所形成的沉淀物及抗原抗体比例关系绘制反应曲线。,8,9,抗原-抗体反应的基本检测方法,1.凝集反应,2.沉淀反应,3.免疫标记技术,10,我科现在用凝集反应检验的项目主要有
3、FDP和RPR。主要特点是灵敏度比较低，需要人肉眼观察结果，对检验人员熟练程度有一定要求。,11,沉淀反应,当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。,检测项目：IgG 、A 、M，C3、C4、ASO 、 RF、PA 、CRP 、尿csf 、NAG等。,12,13,优点:灵敏度高（高于单扩法5-10倍），稳定性好（CV10%），操作简便，结果准确不足:抗体用量较大；溶液中的抗原-抗体复合物分子应足够大，分子太小阻挡不了光线的通过；数量要足够多，否则溶液浊度变化太小
4、，对光通量影响不大；对光度计的灵敏度要求高，这样微小的浊度变化能引起透光率改变，因此通常要加增敏剂。灵敏度较散射比浊法低。 增敏剂自凝出现非特异性凝集。,透射比浊法方法评价 (我们科室现在都是这种方法）,14,粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关，其公式如下：I I042（dn/dc) 2 Mc(1+cos)N24,免疫散射比浊法 (我们科马上要引进的特种蛋白仪所用技术）,15,16,免疫标记技术,1.酶免疫技术 2.化学发光免疫技术 3.免疫荧
5、光技术 4.免疫印迹技术 5.放射免疫技术,17,(1) 酶免疫测定 (enzyme immunoassay, EIA),酶免疫测定（Enzyme ImmunoAssay,EIA）是指用酶（如HRP, AP）标记抗原或抗体然后进行反应，将抗原抗体反应的特异性和酶促反应的高效性相结合。,18,我们科常用酶免技术检测的项目有：甲，乙，丙，丁，戊肝和HIV。,19,20,HAV感染标志物出现时间,21,HAV感染检测标志物,HAV-IgM： 一周内阳性占45%12周内出现阳性35%24周内出现阳性10%可用于甲型肝炎的明确诊断 HAV- IgA 分泌型抗体 HAV- IgG 出现较晚，几乎终身存在，
6、阳性说明曾有过感染，保护性抗体 HAV-Ag 急性感染发病前115 天，粪中阳性率为70% 85%，发病 一周可降为一半左右，发病半个月后很难检测到是特异性诊断指标 HAV-RNA 病毒存在的指标,22,23,乙肝“三对”,乙肝表面抗原(HBsAg)：最早出现在血液中的病毒抗原乙肝表面抗体（抗HBs ）：中和或保护抗体乙肝e抗原（HBeAg）：第二个出现在血液中的病毒抗原乙肝e抗体（抗HBe）乙肝核心抗体（抗HBc）：最早出现在血液中的抗体（IgM）乙肝核心抗体（抗HBc）： IgG,24,HBsAg,HBsAg是S基因编码的一个蛋白，容易发生变异。 HBsAg有一个特异的共同抗原决定簇“a”
7、和至少两个亚型决定簇“dy”和“wr” 血清型为adw、adr和ayw我国绝大多数地区以adr为主, adw次之，新疆、西藏、内蒙古自治区的本地民族几乎全为ayw。,25,HBsAg：ELISA方法检测下限可达015ng/ml假阴性的可能因素：1、HBsAg含量低于所用方法的测定下限之下2、编码HBsAg的HBV S基因的突变3、丙肝与丁肝重叠感染对HBsAg复制和表达的抑制作用4、试剂所用抗体对HBV不同基因型检测敏感性的不同,26,HBsAg的变异可致不常见的血清学标志物模式(1)单独HBcAb阳性(2)HBsAg阴性但HBeAg阳性(3)HBsAg阴性但HBcAb和HBsAb阳性(4)H
8、BsAg(HBeAg)和HBsAb(大多为 2个月2 重组或多肽 间接 3-4 周3 重组+多肽 夹心 2-3 周4 抗原+抗体 夹心 2周左右,HIV抗体试剂盒进展,33,化学发光免疫分析,化学发光物标记的化学发光免疫分析是一种用化学发光物直接标记抗体或抗原，测定反应后抗原抗体复合物上的发光强度来了解抗原或抗原浓度的一类免疫分析法（故称直接化学发光法）。该方法结合了化学发光技术和磁性微粒子分离技术，以细小的顺磁性微粒为固相载体。其测定原理与双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争结合法等相同。,34,发光,Y,Y,Y,磁微粒,被测抗原,+,抗体,+,带丫啶酯标记物抗体,冲洗后,双抗体夹心法,直接化学
9、发光的机理,（1） 加入酸性H2O2 （pH10）,35,内分泌激素类、肿瘤标志物类、肌钙蛋白、梅毒lgG、治疗性药物浓度、生长激素、骨代谢指标和贫血类等方面的检测。,我们科用用化学发光法检测的项目,36,甲功检测,TT3,TT4,rT3,结合态(BT3) 99.7%,结合态(BT4) 99.97%,游离态(FT3) 0.3%,游离态(FT4) 0.03%,与TBG（主要）TBPA、ALb结合,发挥生物效应的部分，能真正反映甲功情况,一种无活性的甲状腺激素，95%由T4转化而来，仅5%由甲状腺分泌，对调节T3、T4的最佳浓度水平发挥作用,37,甲功检测,38,模式分析：1 常规检测与判定顺序：
10、TSHFT3FT4T3T4（甲亢）TSH=FT4T4FT3T3（甲减）2 T3可作为判断疗效的可靠指标，只有T3降至正常，才能表明甲亢患者痊愈。甲减时，T4的降低先于T3的降低，比T3可靠。3 甲状腺素（T4）全部由甲状腺分泌，而三碘甲腺原氨酸（T3）仅有20%直接来自甲状腺，其余约80%在外周组织中由T4经脱碘代谢转化而来。T3是甲状腺激素在组织实现生物作用的活性形式。,39,梅毒血清学检验,1.非梅毒螺旋体抗原血清学试验:梅毒螺旋体破坏宿主细胞释放以及其螺旋体细胞表面释放的类脂物质，刺激机体产生抗类脂抗体（反应素）。在体外该抗体与心磷脂、卵磷脂和胆固醇组成的抗原反应，形成凝集反应。方法：V
11、DRL、USR、RPR、TRUST2. 梅毒螺旋体抗原血清学试验：基于TP特异性抗原，检测TP抗体方法： FTA-ABS、TPHA、 TPPA、ELISA、TP-RT、IgG,40,梅毒血清试验假阳性因素：,技术性： 标本的污染 溶血 操作失误 生物学假阳性： 某些疾病：结核、疟疾、肝病、红斑狼疮、流感、肺炎、类风湿性关节炎、风湿性心脏病、风疹、系统性硬化症等，疾病发展过程中释放心磷脂到血液中假阳性。 生理机能发生变化：少数孕妇也可发生生物学假阳性。,41,RPR 梅毒lgG 临床意义 初期梅毒早期或排出+ + 现症梅毒+ 生物学假阳性 + 梅毒经治疗后,梅毒血清学实验方法学评价,42,自身免
12、疫性疾病和自身抗体的检测,2018/9/29,43,/85,常见的自身免疫性疾病,系统性红斑狼疮（SLE） 类风湿关节炎（RA） 干燥综合征（SS） 多发性肌炎（PM）/皮肌炎（DM） 硬皮病（Scleroderma,Scl） 多发性硬化症（MS） 自身免疫性肝炎 内分泌系统自身免疫病：桥甲炎、Graves病、T1DM、Addison病等,43,2018/9/29,/85,自身抗体一般特点和临床价值,自身抗体 是自身免疫性疾病重要标志 各种自身免疫性疾病伴有特征性自身抗体谱 高效价自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床确诊自身免疫性疾病重要依据 测定自身抗体有助于疾病诊断、活动程度、疗效
13、观察、指导用药 自身抗体已经纳入某些自身免疫性疾病诊断标准中： SLE：抗dsDNA、Sm抗体； ACL抗体与磷脂增综合征； 抗CCP抗体与RA。,44,2018/9/29,/85,常见自身免疫性疾病的标志抗体,45,2018/9/29,/85,自身抗体检测实验室方法,首选IIF（间接免疫荧光法）： 系统性自身免疫性疾病常选HEp-2细胞作为检测基质 器官特异性自身免疫性疾病以特异性组织切片为基质 对自身免疫性疾病进行抗原特异性区分，可选择 免疫印迹,46,自免肝抗体谱,2018/9/29,/85,抗核抗体（Antinuclear Antibody，ANA）,一组将自身细胞核成分作为靶抗原的自
14、身抗体的总称，主要是IgG型，无器官和种属特异性，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中，是重要的筛查试验。 间接免疫荧光法（IIF）：总ANA筛查试验，以人喉癌上皮细胞（HEp-2细胞系）作为基质细胞，或联合灵长类肝细胞基质检测。 常见ANA荧光图形及临床意义：均质型、颗粒型、核膜型、核仁型,47,2018/9/29,/85,均质型,细胞核均匀着染荧光 抗ds-DNA抗体 ssDNA抗体 抗核小体抗体 抗组蛋白抗体 高滴度见于SLE 低滴度见于RA、慢性肝病、传单或药物诱发的狼疮患者,48,2018/9/29,49,/85,颗粒型,即斑点型，细胞核内出现颗粒状荧光 抗核糖体核蛋白抗体，如抗U-nRNP、LAP2、LBR、MAN1抗体 高滴度见于MCTD，SLE,SS,硬化症。,49,2018/9/29,/85,核膜型,即周边型 主要有： 抗板层素 核孔复合体 内膜抗体 目前认为高滴度主要见于原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者。,50,2018/9/29,/85,核点型（DOTS） 抗着丝点型,51,见于SLE、SS、PBC、风湿病,
