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1、1,第十一章,重组基因的导入和鉴定,重组基因的导入和鉴定,第一节 基因转移的方法,一、基因转移的物理方法,裸DNA直接注射* 微粒轰击* 电穿孔 显微注射*,二、基因转移的化学方法,磷酸钙共沉淀法* DEAE葡聚糖转染法 脂质体转染法,三、基因转移的生物方法,2、病毒介导的基因转移,3 花粉管通道,4 叶绿体基因组转化,1 载体介导的转化方法,（1）原生质体共培养法*,（2）叶盘共培养法*,（3）悬浮细胞或愈伤组织共培养*,（4）活体接种,第二节 重组体的筛选与鉴定,一、遗传检测法* 二、物理检测法* 三、菌落或噬菌斑杂交筛选法* 四、免疫化学检测法 五、DNA-蛋白质筛选法 六、转译筛选法,
2、*重点,3,构建重组体DNA是分子生物学常用技术。它把经过处理的、具有匹配末端的外源片段和载体进行连接,转化感受态细菌后,经生长、筛选或鉴定,获得含目的DNA 的转化菌。本章讨论外源重组基因转入受体细胞的方法，及其重组子的鉴定。,4,第一节 基因转移的方法,在确定染色体DNA是遗传的主要载体后的一段较长时间内，人们一直认为虽然生物种类繁多，表型各异，但决定每种生物基因组的DNA是固定的，包括数目固定、位置固定、功能固定的一系列基因。他们的流动性受到十分严格的限制。,5,随着遗传学研究的深入，人们逐渐发现细菌的结合、转导、转化、转座等现象，在这些事件中存在明显的遗传物质转移，而这种转移与生物繁殖
3、过程中的遗传物质的转移有显著区别。这些现象后来成为基因工程的基因转移技术。可以用于细菌、真菌和动、植物的基因工程体构建。,6,一、基因转移的物理方法,裸DNA直接注射 微粒轰击 电穿孔 显微注射,物理方法,7,(1)裸DNA直接注射,1990年Wolff等首次注意到给小鼠直接肌肉注射纯化的DNA或RNA重组表达载体，可使载体上的基因在局部肌细胞内表达，这种表达可持续数日或更长时间，且没有检出注射的外源核酸与宿主染色体整合。 随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNA接种后可诱导机体产生细胞及体液免疫。于是，作为一种新的基因治疗手段核酸免疫技术应运而生。,8,9,10,11,提高转化效率措施
4、,实验表明，横纹肌细胞(如心肌、骨傍肌)和胸腺滤泡细胞摄取DNA的能力较强，但实际上质粒DNA注射入肌组织后，最多只有1-2的肌纤维被转染，DNA的转染效率不仅与质粒DNA的大小、构型有关，还与肌细胞的状态有十分密切的关系。 人们为提高肌细胞摄取DNA的能力采取了一些措施，如在质粒接种前先给予高渗蔗糖溶液、心肌毒柬或麻醉剂(如利多卡因)的预处理。,12,(2)基因枪介导的皮内或皮下导入,首先利用微小的金、钨等金属颗粒相DNA吸附，然后在高压作用下将DNA伴随金颗粒高速进入细胞，由于微粒的直径一般在0.5-0.9 Fm之间，远小于细胞 因此可直接将DNA导入细胞质中，这种方法能有效地使DNA在活
5、体组织、贴壁细胞和悬浮细胞中表达。由于该方法的高转染效率，通常只得少量DNA即可获得外源基因的表达并激发有效免疫应答。,13,80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。,该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。,(2)基因枪介导的皮内或皮下导入,14,(2)基因枪介导的皮内或皮下导入,首先将钨、金微粒(直径约0.4m，重量约0.05mg)与供体DNA溶液(12l)混合并保温，使DNA吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的“基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质
6、或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以进入受体细胞。,操作技术程序为：,15,16,17,基因枪所用材料： （1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。,（2）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。,（3）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。,基因枪法的特点：（1）转化效率高。,（2）受体广泛。,（3）操作简单。,18,(3)电穿孔(electroperation),该方法利
7、用脉冲电场提高细胞膜的通透性，使细胞膜上形成纳米大小的微孔，可将DNA转移到细胞中。该方法简便，且有较稳定的转染效率，可广泛运用于培养细胞的基因转移.,19,原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（Vm）约为l00mV，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。,可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。,不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。,20,操作程序：,将盛有细胞和DNA混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负极之间，在0度下加高压（2
8、4KV），电脉冲10分钟后，将待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长2天，再进行筛选。存活细胞的回收率约为60% 80%。,21,(4)显微注射,指在显微镜下，将DNA由细胞玻璃针直接注入细胞。可以将DNA直接注入核内而减少溶酶体对外源DNA的降解，有助于基因的整合与表达。 适用于多种贴壁生长细胞及悬浮生长细胞，包括原代及传代细胞、胚胎细胞等。,22,微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头道进入。,真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。,(4)显微注射,23,固定细胞技术,显微注射技术的关键是原生
9、质体或具壁细胞或细胞团的固定。 首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。 常用的细胞固定方法有3种： 一、琼脂糖包埋法 二、多聚赖氨酸粘连法 三、吸管支持法,24,二、基因转移的化学方法,化学方法,磷酸钙共沉淀法 DEAE葡聚糖转染法 脂质体转染法,25,(1)磷酸钙共沉淀法,当CaCl2、DNA和磷酸盐缓冲液缓慢混合时，即有磷酸钙微细沉淀形成，这些细小颗粒可以吸附在细胞表面，通过细胞膜的内吞作用将DNA吸收进入细胞质面后进入细胞核，其详细机制尚不明确。 DNA多以多拷贝首尾相连的串珠状排列进入细胞，在细胞中常以多拷贝形式存在。,26,27,该方法操作简单，又不需特殊仪器，瞬间
10、转移效率最高可达到20，但长期表达效率较低，目前已被广泛运用于离体细胞的基因转移，是最普遍使用的方法之一。,28,(2)DEAE-葡聚糖转染法,二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子量的多聚阴离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA，因此被用于基因转染技术。其促进细胞捕获DNA的机制还不清楚，可能是因为葡聚糖与DNA形成复合物而抑制了核酸酶对DNA的作用，也可能是葡聚糖与细胞结合面引发了细胞的内吞作用。该方法可广泛用于转染病毒、病毒序列及其他DNA，适合于细胞瞬间表达检测及小量DNA的转染。,29,(3)脂质体转染法,将磷脂、胆固醇或其他脂类的乙醚溶液加入到DNA溶液中，经特殊处理得到单层或双层的带D
11、NA的脂质体小泡，通过与细胞膜融合，被细胞内吞而实施基因转移。这类方法基因转移效率很高，据报道最高时，100离体细胞可以瞬时表达外源基因。,30,三、基因转移的生物方法,(一）载体介导,质粒,Ti质粒-土壤根瘤菌 Ri质粒-发根土壤根菌,逆转录病毒(Rv)载体 腺病毒(Ad)载体 腺相关病毒(AAv)载体 单纯疱疹病毒(HSv)载体 嵌合病毒载体,病毒,31,质粒,两种病原土壤杆菌根瘤土壤杆菌( Agrobacterium tumefaciens) 和发根土壤根菌( Agrobacterium rhizogenes) 分别含有Ti和Ri质粒为基因克隆载体介导的基因转移。,32,33,1、共培养
12、法(cocultivation),Marton等1979年以原生质体为受体建立，随后经过一系列的改进，现在是植物基因工程中最常用的一种转化方法。 主要原理是将受体与供体在一起培养，通过接触感染而发生转移，供体常用农杆菌、病毒载体等形式。,（一）载体介导的转化方法,34,（1）原生质体共培养法,取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。,1、共培养法(cocultivation),35,从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养24小时。 原生质体与农杆菌混合培养，原生质体浓度l05ml、农杆菌l07ml，20下保温32小时。 冲洗去
13、游离的细菌，将原生质体培养在有抗生素(250mgL万古霉素，200mgL羧苄青霉素，200mgL链霉素)的培养基中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。 3周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，2周内，转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中可快速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。,烟草原生质体与Ti质粒转移的共培养法程序为：,36,37,（2）叶盘共培养法,该方法最早由Horsch(1985)首创，用于烟草转化 。,优点：适用性广，对于那些能被农杆菌感染的、并能从叶子再生植株的各种植物均适用。,38,（3）悬浮细胞或愈伤组织共培养,原则上，该种共培养与
14、原生质体共培养的方法和步骤是相同的，在供体上，则必须是有侵染和感染能力的载体系统，如带有Ti质粒的根癌农杆菌。,39,所谓整体植株接种转化法，是指人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌注射到植物体内，使农杆菌按照天然的感染过程在植物体内进行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。接种后2-3周，切下接种处部分组织培养4周，可产生愈伤组织，进一步通过分化培养可获得转基因植株。,（4）活体接种(inoculation in vivo),40,2、病毒介导的基因转移,（1）双链DNA病毒转化载体,这类病毒是以双链DNA作为遗传物质，在这类病毒中，目前研究的最多
15、的是花椰菜花叶病毒（简称CaMV, Caullinus Mozic Virus）。,（2）单链DNA病毒转化载体,GeNV顾名思义，可翻译成“双联体病毒”或“孪生病毒”。GeNV的感染范围较广，包括单子叶和双子叶植物，它们的传播媒介是昆虫。,（3）单链RNA病毒转化载体,迄今为止，还没有建立起一个完善的以植物RNA病毒为基因载体的基因转化体系，但是RNA病毒仍是一个很有希望作为基因工程载体的植物病毒。,41,3 花粉管通道,在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成
16、为带转基因的新个体。 该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。 该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。,42,4 叶绿体基因组转化,1990年Svab 等利用基因枪轰击法获得烟草叶绿体转基因植株。 叶绿体基因组转化技术在外源基因的导入,外源基因的整合与表达,转基因植株的筛选等方面都取得了长足的发展。 到目前为止,叶绿体基因组转化技术已在烟草、拟南芥、马铃薯、油菜、番茄和水稻等高等植物中获得了成功。,43,第二节 重组体的筛选与鉴定,一、遗传检测法,二、物理检测法,三、菌落或噬菌斑杂交筛选法,四、免疫化学检测法,五、DNA-蛋白质筛选法,六、转译筛选法,44,一、遗传检测法,1、根据载体表型特征选择重组体分子 质粒、柯斯载体-抗药性记号或营养记号 噬菌体-噬菌斑,45,pBR322质粒-四环素抗性基因(tetr)和氨卞青霉素抗性基因(ampr)。,将转化的细胞培养在含有四环素或氨卞青霉素的生长培养基中, 检测出获得了此种质粒的转化子细胞。,
