《质谱分析法鉴定多形汉逊酵母pex14p的磷酸化位点》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质谱分析法鉴定多形汉逊酵母pex14p的磷酸化位点（21页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、质谱分析法鉴定多形汉逊酵母Pex14p的磷酸化位点,Identication of phosphorylation sites in Hansenula polymorpha Pex14p by mass spectrometry,Pex14p是过氧化物酶体膜蛋白，它既参与过氧化物酶体的增殖，也参与过氧化物酶体的选择性降解。 作者之前发现，活体多形汉逊酵母中的Pex14p 是以磷酸化状态存在的。,但是，具体的磷酸化位点和生理作用尚未知道。 本文通过质谱分析确定了Pex14p的具体磷酸化位点，并试图分析其在过氧化氢酶体增殖和吞噬中的作用。,H6-Pex14p的cDNA和pHIPX4 载体连接，得
2、到pHIPX4-H6PEX14，转化pex14细胞。 用含甲醇的培养基诱导酵母表达，培养基中仅含有32P的磷酸盐。酵母中过氧化物酶体大量增殖。 随着时间增长， Pex14p中的磷酸化位点都会变成32P标记的。 质谱分析,A 从过表达酵母菌株中提取H6-Pex14p ，然后进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色 B 划线部分是观测的多肽序列，带*的是磷酸化位点 C 通过分析质谱图得知，磷酸化位点在Thr248和Ser258,为了进一步研究磷酸化的生理作用，作者选育三种不同的突变株，分别是T248A 、S258A 和T248A/S258A 突变体。 分别用Ala取代T248和S258,Pex14p的
3、western blot结果中，野生型（WT）呈现三条带推测T248A的Pex14p是因受激发而呈现 三条带，具体原因尚不明确S258A 和T248A/S258A 突变体分别呈现 两条带和一条带,野生型（WT）的酵母细胞，转移到甲醇平板后，产生大量过氧化氢酶体，磷酸化的Pex14p迅速诱导产生，非磷酸化化的Pex14p迅速减少，直至24h后检测不到 T248A 突变体的Pex14p动态与WT的很相似 S258A突变体的Pex14p 动态与WT大体相似，只是直到24h还存在着非磷酸化带 T248A/S258A 双突变体只呈现一条非磷酸化的Pex14p 条带,之后转移到葡萄糖培养基中，此时过氧化物
4、酶体被选择性吞噬。 在吞噬过程中，过氧化氢基质蛋白也被降解，如AOX。,转移到葡萄糖培养后，WT细胞中磷酸化的Pex14p因为吞噬作用在最初的0.5小时内迅速减少 相比之下，非磷酸化的Pex14p呈现相对缓慢的降解速度 Pex14p降解的过程中，所有的突变体表现出了相同的动力学特征,在野生型细胞中，通常是通过醇氧化酶（AOX)的降解来判断过氧化物酶体吞噬作用的 各种细胞中AOX的降解情况都非常相似。并且降解产生的低分子量的产物也已被检测到,去核后上清（PNS）30000g离心得到细胞器膜球团（P）和上清（ S ） AOX醇氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白 AMO胺氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白,去核后上清（PNS）30000g离心得到细胞器膜球团（P）和上清（ S ） AOX醇氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白 AMO胺氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白,在过氧化氢酶体诱导的条件下，Pex14p 在Thr248和Ser258的磷酸化作用，不影响基质蛋白转运进入过氧化氢酶体。,在过氧化物酶体增殖和选择性降解过程中，与野生型相比，突变体并没有明显的表型差异。Pex14p的磷酸化位点的具体作用还有待进一步研究。,peroxisomal targeting signal-1 (PTS1),FEBS Open Bio 2013,
