《疫苗2-新型疫苗(生物制品课件)培训材料》由会员分享，可在线阅读，更多相关《疫苗2-新型疫苗(生物制品课件)培训材料（89页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生物制品学,艾滋病疫苗国家工程实验室张海红,第三篇 基因工程疫苗,第一章 基因工程 第二章 基因工程疫苗 第三章 基因工程疫苗质量控制,第一章 基因工程,第一节 基因工程概述第二节 基因工程产品的生产过程,第一节、 基因工程概述,一、基因工程的定义 二、基因工程的基本操作程序 三、基因工程历史上的重要人物 四、 理论基础,一、基因工程定义,基因工程(Genetic engineering)是一种DNA重组技术，它是在分子水平上进行的遗传操作，即把供体细胞中的基因或基因组提取出来，按照预先设计的蓝图，经过体外加工重组，或者把人工合成的基因转移到受体细胞并获得新的遗传特性的技术。由于被转移的基因必
2、须与载体DNA重组后才能实现转移，所以基因工程也叫做重组DNA技术。,二、基因工程的基本操作程序,（1）目的基因的分离或合成； （2）用工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加工处理，把目的基因与载体结合成重组DNA分子； （3）把重组DNA分子引入受体细胞，并使目的基因和载体上其他基因得以表达； （4）转化体细胞的扩增； （5）重组体细胞的鉴定与筛选。,三、基因工程历史上的重要人物,不能忘记的人,Paul Berg,伯格（美国生物化学家）通过把两个不同来源的DNA连结在一起并发挥其应有的生物学功能，证明了完全可以在体外对基因进行操作。他作为“重组DNA技术之父”于1980年获诺贝尔化学奖
3、。,不能忘记的人,Kary B Mullis,1985年穆利斯发明了高效复制DNA片段的聚和酶链式反应（PCR）技术，利用该技术可从极其微量的样品中大量生产DNA分子，使基因工程获得了革命性发展。,四、理论基础,不同基因具有相同的物质基础； 基因是可切割的； 基因是可以转移的； 多肽和基因之间存在对应关系； 遗传密码是通用的； 基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。,第二节 基因工程产品的生产过程,一、构建过程示意图 二、发酵的一般过程 三、下游加工过程,2. 生产过程,上游构建 （基因工程）,发酵生产 （发酵工程）,纯化制备,一、构建过程示意图,从细胞中分离出目的DNA,1.载体（Vecto
4、r）的选择,种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。,选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选 和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点 （多克隆位点）；分子量小，以容纳较大的外源DNA。,质粒 （Plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,大小约为数千碱基对。常有1 3个抗药性基因，以利于筛选。,原核表达体系：如大肠杆菌（ E. coli ）等,2.表达体系的选择,优点： 强启动子,表达量大翻译调控序列生产简单,不足： 缺乏转录后加工机制缺乏翻译后加工机制表达产物形成不溶性包涵体很难表达大量可溶性蛋白,优点：可适当修饰表达的蛋白质一般具
5、有天然活性表达产物分区积累,真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞和植物细胞,缺点：操作技术难、费时、不经济,酵母菌的结构,二、发酵的一般过程,发酵工艺多种多样，但基本上包括以下三个过程:,发酵罐的结构示意图,1、菌种制备2、种子扩大培养3、大规模罐批培养,三、下游加工过程,从发酵液中分离、精制有关产品的过程称为发酵生产的下游加工过程。它是生产过程中最重要、成本费用最高的环节。,至今高效液相色谱仍是最常用的手段。,一般可分为四个阶段：1、发酵液预处理和固液分离2、提取3、精制4、成品加工,基因工程疫苗,第一节 基因工程亚单位疫苗 第二节 基因工程载体疫苗 第三节 核酸疫苗 第四节 基因缺失活
6、疫苗 第五节 蛋白工程疫苗 第六节 转基因植物疫苗 第七节 基因工程疫苗的优越性及其发展重点,第一节 基因工程亚单位疫苗,一、 定义 二、 抗原基因的选择 三、 表达系统,一、定义：,又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，主要指将病原微生物的抗原基因用分子生物学的方法分离，然后与载体DNA相连接，在经载体将抗原基因带进受体进行复制与表达，最后将基因工程表达的蛋白质抗原分离纯化后制成疫苗。,二、抗原基因的选择,1、一般选择病原体表面糖蛋白编码基因 2、对于易变异的病毒（如HA）则应选择各亚型共有的核心蛋白的主要保护性抗原基因 3、一般选择两种以上的抗原基因构建重组体,三、 表达系统,1、种类：
7、 大肠杆菌：BL21 枯草杆菌: 酵母细胞: 毕赤酵母 昆虫细胞：SF9 哺乳细胞：CHO、 转基因植物: 番茄、马铃薯、香蕉 转基因动物: 牛,三、 表达系统,2、表达系统选择的依据（1）表达抗原的免疫原性强弱蛋白翻译后修饰哺乳细胞 酵母细胞 大肠杆菌（2）表达效率的高低 大肠杆菌 酵母细胞 哺乳细胞（3）表达产物纯化的难易程度 表达量越大越容易纯化 带标签的容易纯化,基因工程亚单位疫苗的优缺点,优点: 与传统疫苗相比，安全性较好缺点：免疫效果价差增强免疫原性的方法： 调整基因组合，使其表达成颗粒结构 在体外将抗原聚团化，如包入脂质体或胶囊微球 加入有免疫增强作用的化合物作为佐剂,第二节 基
8、因工程载体疫苗,一、定义： 利用微生物作载体，将保护性抗原基因重组到微生体中，利用这种能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗，称载体疫苗。 二、分类 以细菌为载体的基因工程疫苗 以病毒为载体的基因工程疫苗,1、以细菌为载体的基因工程疫苗,减毒的沙门氏菌和卡介苗是最重要的和用途最广的载体；前者能诱导粘膜免疫反应，后者以诱导细胞免疫为主。 减毒沙门氏菌载体 伤寒沙门氏菌是一种肠道致病菌。美国FDA批准用于临床的伤寒Ty21a减毒活疫苗显示了很好的安全性和免疫原性。 至今已有结核杆菌、霍乱弧菌、乙肝、流感、和血吸虫等数十种病原微生物的外源基因在沙门氏菌的减毒活疫苗中获得了不同程度的表达。,卡介苗
9、载体：卡介苗的使用已有半个世纪，全世界已有40多亿人接种过卡介苗，诱导的反应可长达5-50年。是理想的表达载体。 但是临床试验结果并不理想，主要原因是卡介苗本身会刺激接种者产生很强的针对分枝杆菌的免疫反应。,2、以病毒为载体的基因工程疫苗,可视为病毒减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫苗的结合。主要有：痘病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、和单纯疱疹病毒。,1、痘病毒,优点： （1）安全性好，是人类使用了近200年的最为安全的疫苗； （2）宿主广泛，能感染多种类型的细胞； （3）插入外源基因的容量大，可插入20kDa的外源基因。 （4）易培养，病毒自身的耐热性强和容易获得高效价的培养特点。缺点：虽然已有很多牛
10、痘基因工程疫苗进入临床试验阶段，但还有很多问题需要克服，如不能口服，接种过天花疫苗的人有预存免疫等问题。,2、腺病毒,优点：缺点：预存免疫,第三节 核酸疫苗,核酸疫苗的研究背景构建核酸疫苗的基本要素目的基因和载体核酸疫苗的优缺点,核酸疫苗的研究背景,1992年，Tang等给小鼠直接注射含有人生长素基因的质粒DNA，诱导小鼠产生了针对人生长激素的抗体，标志着核酸疫苗的出现。1994年，开始，美国FDA已陆续批准了艾滋病、流感、乙肝、单纯疱疹病毒、疟疾和癌胚抗原等核酸疫苗进入临床。1995年美国纽约科学院召开会议专门研讨DNA疫苗，称之为疫苗学的新纪元和疫苗的第三次革命,构建核酸疫苗的基本要素,1
11、、目的基因 可以是针对某一抗原的单基因片段或基因的cDNA,也可以是一组基因、多个基因（多重抗原性基因）或嵌合型基因。 是核酸疫苗设计的关键因素。,构建核酸疫苗的基本要素,2、DNA疫苗的载体 （1）可以克隆外源基因的多重限制性内切酶位点 （2）具有真核细胞启动子 （3）具有CpG核苷酸基序 （4）具有用于选择的标记最好卡那霉素，氨卡青霉素有预存免疫 （5）具有能在大肠杆菌中复制的基因,核酸疫苗的优点,（1）免疫保护力增强。CTL应答是机体杀死癌变细胞的有效清除途径。肿瘤基因疫苗接种机体后，其表达的内源性抗原有利于MHC-类分子的抗原提呈和CTL的产生，从而产生强有力的细胞免疫，并促进体液免疫
12、功能的加强，从而预防和免疫治疗肿瘤。（2）产生持久免疫应答，肿瘤DNA疫苗可在体内长时间表达，持续的刺激免疫系统，使其抗瘤作用持久存在，在肿瘤的治疗和预防上均有着广阔的前景。（3）有很好的可控性，其诱生的免疫反应的强度和方向性，可通过改变接种方法和部位、质粒中的免疫刺激序列以及细胞因子和共刺激分子基因的同时使用等进行调整，可将多个抗原表位基因克隆在同一表达载体而制备成多价疫苗的特点，是常规疫苗无法比拟的。,核酸疫苗的优点,（4）肿瘤DNA疫苗具有制备容易、生产成本低廉、可批量生产。（5）质粒DNA稳定性好，便于贮存和运输，无须冷藏、使用方法简单，有利于将来的推广应用。（6）安全性好，由于基因疫
13、苗一般采用表达载体在动物细胞体内进行抗原表达，不与宿主染色体DNA整合。因此与传统疫苗相比，基因疫苗的应用性和可操作性都大为增强。,第四节 基因缺失活疫苗,就是应用基因操作技术，将病原微生物中与致病性有关的毒力序列除去或关闭，使之成为无毒株或弱毒株，但仍保持有良好的免疫原性，从而制成安全有效的疫苗。 优点：与自然减毒株相比，基因缺失突变株具有突变性状明确、稳定、不易返租等优点。,第五节 蛋白质工程疫苗,是指将抗原基因加以改造，使之发生点突变、插入、缺失等构型改变，甚至进行不同基因或部分结构域的人工组合，以增强其产物的免疫原性、扩大反应普、去除有害作用或副反应的一类疫苗。,第六节 转基因植物疫苗
14、,目的 ：通过导入特定的外源基因来获得转基因植物，以改良作物、研究植物基因功能、生产具有重要经济价值的蛋白质等。研究的两个方面： 1、与植物重要生命活动有关的基因或其cDNA的克隆。 2、将外源基因导入并整合到植物基因组以获得转基因植物。,一、生产疫苗用转基因植物的选择,作为生产疫苗用的转基因植物应有的特点： 该植物可以在世界上较多地区，特别是发展中国家种植，并能获得较高的产量； 容易该婴幼儿喂服，并能被家长们接受； 作为疫苗的植物，其可食部分必须是可生食的 含有较高的蛋白质含量。,1、 烟草,优势： 是植物组织培养和遗传转化的模式生物，易获得转基因植物； 蛋白质含量丰富，可通过纯化技术获得；
15、 劣势： 但含有个尼古丁等有害物质,2、马铃薯,优势： 马铃薯的遗传转化体系已经建立，在很短的时间内即可获得大量的转基因植物； 马铃薯可使用的块茎组织特异性启动子已被克隆，可使外源基因在块茎内特异的大量表达； 马铃薯的组织培养快速繁殖系统业已成熟，可以供应大量遗传背景一致的种苗； 马铃薯可以被很多动物食用，动物实验不成问题。 劣势： 马铃薯块茎蛋白质含量较低， 人类无生食马铃薯的习惯。,3、香蕉,优势： 在东南亚、非洲、印度次大陆、河南美等发展中国家被大量种植，价格非常便宜； 香蕉的蛋白质含量较高，一个香蕉可以给10个婴儿接种免疫 可以口服。 劣势： 香蕉的组织培养和遗传转化研究尚待进一步完善
16、，至今还没有转基因香蕉种植成功的报道。,二、转基因植物的优越性,1、植物具有全能性。 2、植物细胞具有完整的真核细胞表达系统。表达产物可进行反以后修饰和加工，与高等等动物细胞表达的抗原具有一致的免疫原性及生物学活性。 3、可诱导黏膜免疫反应。黏膜免疫是人体的第一道屏障。 4、生产简单，成本低廉。阳光和土地 5、接种简单。可口服 6、安全。本质即食物，安全可靠。,三、目前在研的几种主要的转基因植物疫苗,主要研究方向： 利用植物作为工厂来生产大量的蛋白质抗原，然后经过分离和提纯，在制备成疫苗； 不需要分离提纯，将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。,1、非直接口服的转基因植物疫苗,1） 乙肝表面抗原转基因植物疫苗 基因插入质粒载体，转入农杆菌后在转入烟草，颗粒为22nm，与人血清中的类似，而酵母表达的颗粒为17nm。 2） 诺瓦克病毒衣壳蛋白转基因植物疫苗 诺瓦克病毒是能引起腹泻的病原体，每年造成300万儿童死亡。用烟草表达量可达烟草的0.23% 3） 狂犬病毒糖蛋白转基因植物疫苗 McGarvey等在番茄中表达的狂犬病毒表面糖蛋白，能与病毒天然蛋白质产生的抗体形成免疫沉淀，并在小鼠中测到了中和抗体。,
