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1、流式细胞术原理和应用,王彩纹 Tel:15979070699 E_mail:Wangc_,一、淋巴细胞,淋巴细胞简介,淋巴细胞是构成机体免疫系统的主要细胞群体，其显著特征是其异质性，可分为许多表型和功能均不同的群体：T、B、NK等。,T细胞亚群,T淋巴细胞（T细胞） 胸腺依赖性淋巴细胞 （thymus- dependent lymphocyte） 外周血：约占淋巴细胞总数的65%75% 胸导管：高达95%以上,T细胞亚群及其功能,分类,按表达TCR类型不同,按表达的CD分子不同,CD4+T细胞,CD8+T细胞亚群,按功能不同,辅助性T细胞 (Th),细胞毒性T细胞 (CTL或Tc),调节性T细
2、胞 (Tr或treg),按对抗原应答所处状态不同,初始T细胞,活化T细胞,记忆性T细胞,Th的亚群（根据CK产生种类和功能）,TH1细胞 主要分泌IL-2、IFN- 和TNF-。 作用：参与细胞免疫。 TH2细胞 主要分泌IL-4、5、10和IL-13 。 作用：协助、促进B细胞分化、增殖，产生抗体，参与体液免疫。,CD4+ Th细胞的功能,Tc细胞（细胞毒性T细胞，CTL） 特 点：胞浆内含颗粒（穿孔素、颗粒酶）。 作 用: 特异性杀伤肿瘤和病毒感染细胞。 机 制： （1）颗粒外排（穿孔素，颗粒酶，颗粒溶解素） （2）Fas/FasL途径诱导靶细胞凋亡。,CD8+ Tc细胞的功能,CD45,
3、白细胞共同抗原 蛋白酪氨酸磷酸酶，参与T细胞活化启动 与CD4、CD8分子结合 CD45RA未致敏T细胞 CD45RO效应T、记忆T细胞,二、流式细胞仪工作原理,流式细胞仪与细胞组学,细胞相对定量（） 细胞绝对定量（细胞/ul） 细胞膜蛋白表达定量（蛋白分子/细胞） 可溶性蛋白绝对定量（g/ml）,1、 液流系统 2、 光学系统 3、 数据处理系统,一、流式细胞仪的基本结构,由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其
4、靠近孔壁而阻塞喷孔。,液流系统,流式细胞仪对目标细胞的识别 需要借助对MARKER 进行标记的荧光素,用荧光标记细胞,计数有荧光的细胞占所有 细胞的比例；测定每个 有荧光的细胞的荧光强度,流式细胞仪,阳性细胞百分比或浓度,靶蛋白浓度,上样检测,光学系统,（一）散射光的测定,细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。,前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
5、,侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。,（二）、设门分析技术,Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。 根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞,A、B、C均为任意门,线性门,如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。,D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3-
6、D4 CD4- /CD3+,（三）几种常见的荧光染料,FITC,异硫氰酸荧光素,Texas red,得州红,PE.PC.APC,藻胆蛋白类,PEcy5,能量传递复合染料,细胞悬液,激光,(四)、如何看图,Dot Plot（双参数点图） Histogram（单参数直方图） Region（门） Statistics（统计结果）,参数,单核细胞,细胞分析的瓶颈？ 如何进一步分析和计数这三群细胞内更精细的细胞亚群？ 如何进一步分析和计数各种非造血系统细胞？,淋巴细胞,粒细胞,这三群细胞分别由具有不同功能的细胞组成 这些细胞数量不等，甚至非常稀少 这些细胞表达不同的标记物，是用来区分它们的基础,淋巴细胞
7、,单核细胞,粒细胞,艾滋病人 CD4细胞,总 T细胞,CD4+ T细胞,绝对计数值,绝对计数值,蛋白表达强度,相对计数值,24小时后,6小时内,三、流式细胞仪应用,（一）免疫细胞测定,淋巴细胞亚群（T，B，NK） 活化的淋巴细胞（活化标记） 有功能的淋巴细胞（细胞因子分泌功能） 抗原特异性淋巴细胞 调控性免疫细胞 抗原递呈细胞 先天免疫细胞 嗜碱性粒细胞,外周血淋巴细胞亚群临床意义,外周血淋巴细胞亚群临床意义,纯粹看单次的检测结果和横向比较或与参考值比较可能意义不大 更多的实验室在普通淋巴细胞亚群检测中开始重视单个病人不同时期的细胞数量的变化趋势的意义 多个细胞免疫细胞参数同时检测综合观察 新功能细胞检测,免疫细胞检测临床重要性,病人细胞免疫功能 治疗效果和预后 临床药理研究和新药临床前评估（中药应用前景广泛） 细胞生物治疗,HIV感染患者CD4+细胞的绝对计数,HIV入侵人体的目标细胞是CD4 T细胞，感染后期能严重破坏T细胞，引起CD4细胞的减少 CD4细胞的计数是诊断、疗效观察和预后的最重要指标 CD4细胞绝对数量如果低于200细胞/ul，表明疾病将进入重症期 国家CDC 2005年以来采购了100多台流式细胞仪来配合艾滋病关爱工程和实现对世界的承诺,谢谢指导！,王彩纹于2011年01月,
