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1、1,核酸分子杂交技术,严永敏 细胞与分子诊断系,,2,目 录,基本原理 核酸探针 核酸分子杂交技术,3,变性,在热、酸碱或变性剂作用下，DNA双螺旋的氢键断裂，解离为两条单链DNA的现象称为变性。,变性的特征 生物学活性丧失,增色效应,核酸的变性与复性,4,磷酸二酯键,DNA和RNA的一级结构,5,DNA解链曲线,增色效应(hyperchromic effect) 核酸分子加热变性时，其在260nm处的紫外吸收急剧增加的现象。,Tm值 ：当紫外吸收变化达到最大变化的半数值时，此时所对应的温度称为熔解温度（Tm ）、变性温度或中点解链温度。,8,分子杂交,当两条不同来源的单链核酸分子DNA-RN
2、A或DNA-DNA链之间存在互补的碱基序列时，通过碱基互补配对形成双链杂交体的过程，称为分子杂交（molecular hybridization） 。,分子杂交图,9,10,概念：用同位素或其他化学方法标记的与待测靶核苷酸序列互补杂交的核酸片段（DNA或RNA ）。 用途：检测待检核酸样品中的特定基因序列。(DNA-DNA; DNA-RNA; RNA-RNA) 要求：特异性，来源方便,第二节 核酸探针,11,hybridization,DNA:DNA 5 A T G C C G A T3 T A C G G CDNA:RNA 5 A T G C G T A3 U A C G C A URNA:
3、RNA 5 A U G C U A C G3 U A C G A U G C,12,1)基因组DNA探针； 2)cDNA探针； 3)RNA探针；,核酸探针的类型：,4)寡核苷酸探针。,13,（一）基因组DNA探针 1.来源：这类探针来源于某种生物的基因组 多为某一基因的全部或部分序列。 2.制备方法:（1）基因克隆的方法（2）聚合酶链反应(PCR),14,3.特点:（1）多克隆在载体中的DNA片段，可以无限繁殖，取之不尽。（2）相对RNA而言，DNA探针不易降解，标 记方法也较成熟。,15,（二）cDNA探针1.制备: cDNA文库中筛选。2.特点:不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核
4、酸探针，尤其是用于基因表达的研究。,16,（三）RNA探针,特点：1）单链探针，效率高，灵敏度高；2）RNA/RNA、RNA/DNA更稳定，特异性高；3）不稳定，易降解。,17,（四） 寡核苷酸探针特点 : 根据需要来合成相应的核酸序列，避免天然探针的缺点 ； 大多数长度一般为2050bp ； 由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信 号较弱,18,常用的探针标记物：,放射性同位素：3H、32P、35S、125I等。,核酸探针的标记,特点 : 灵敏度高，特异性高； 检出限：110ug ； 环境污染，半衰期短。,19,常用放射性核素的物理性质, ,非放射性,20,FITC 异硫氰酸酯,TRITC
5、硫氰酸四甲基罗达明,人染色体不同荧光素染色结果,非放射性同位素：荧光染料、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。,21,缺口平移标记法示意图,酶促法1.缺口平移法（nick translation）,探针标记方法:,22,2随机引物法 (random priming),人工合成68bp各种不同排列顺序混合物引物 在DNA 聚合酶作用下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应液中加入一种被标记dNTP时，即可形成标记的DNA探针，但探针DNA序列是长短不等的。,优点：比活度高，结果稳定,23,随机引物标记法示意图,24,3DNA探针的末端标记 （1）Klenow大片段的末端标记法,323个氨基
6、酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段 / Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,25,利用Klenow DNA聚合酶标记3-端DNA探针,26,（2）多核苷酸激酶标记法（polynucleofide kinase，PNK),多核苷酸激酶标记法示意图,*不能进行非放射性标记,27,DNA半抗原标记探针的检测,显色系统：,碱性磷酸酶 NBT 辣根过氧化物酶 DAB,底物,非放射性探针的检测,四唑硝基蓝,二氨基联苯胺,28,制备特异性探针所需要的基本条件,1.被检基因结构清楚；2.有明确的基因产物;3.已知某一基因产物；具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。
7、,29,第三节 核酸分子杂交技术,30,1,tissue,SDS,ProtK,Phenol Chloro,ETOH Spin,一、Southern印迹杂交,31,毛细管转移示意图,电转移示意图,32,Northern印迹杂交流程图,二、Northern印迹杂交,33,Southern杂交结果,Northern杂交结果,34,基因表达产物的检测 Western印迹法,蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。优点: 分辨率高(15ng);特异;简便;稳定,35,准备PAGE胶,样品的制备,加样,SDS-PAGE,(蛋白先定量),蛋白质的电转移,抗体结合与显色检测,判断结果,实验流程:,36,聚丙烯酰胺凝胶分离,37,Western blot蛋白质转移,38,Western blot 显色反应,HRP,39,HRP显色原理,40,SDS-PAGE及Western blotting,SDS-PAGE Western blotting显色,
