《lc-ms基础1》由会员分享，可在线阅读，更多相关《lc-ms基础1（47页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、液质联用技术简介 Introduction in the Application of Liquid Chromatography Mass Spectrometry,s1020429 张晶晶 s1020432 焦广睿,前言,输入文本内容,输入文本内容,输入文本内容,输入文本内容,液质联用技术简介,1,题目,题目,题目,题目,Click to add title,Click to add title,Click to add title,Click to add title,1,2,3,4,Contents,Add Your Text in here,Add Your Text in here
2、,Add Your Text in here,Add Your Text in here,Add Your Text in here,图解,输入数字内容,内容,内容,内容,内容,题目,题目,题目,题目,色谱质谱的在线联用 将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来,色谱,质谱,实现对复杂 混合物更准 确的定量和 定性分析,LC-MS GC-MS,简化了样 品的前处 理过程,液质联用与 气质联用互 为补充，分 析不同性质 的化合物,LC-MS 的特长,MS,LC-MS,试样中的各成分根据固 定相（柱填料）对流动 相中组份保留能力的不 同，进行分离，根据成 分的性质采用UV、荧 光、电导等检测器。这
3、 些检测器对物质的定性 主要根据保留时间，定 量根据峰强度和面积。 色谱仪在分离能力上优 越，但是，对多成分同 时分析有些成分几乎同 时从柱中洗脱的情况， 难于做到准确的定性、 定量。,将试样成分使用不同方 法进行离子化，根据所 得离子在真空中的质荷 比进行分离，是测定各 离子强度的高灵敏度检 测方法。所得的质谱由 于可表示某质荷比的离 子存在的程度，非常有 助于定性分析。质量数 在分子中是特有的信息， 而MS 可以直接取得这些 信息。但是，这是在单一 成分测定时的情况，而在 多数成分同时进样时极难 进行质谱的解析。,分离能力优越的LC 与定性能力优越的MS 相结合的装置，采用扫描测定所得的质
4、谱,提供来自LC 洗脱成分中的分子量与结构信息，根据其他LC 检测器所得的保留时间对定性补充（图1）。另外，在SIM（选择离子监测）中利用质量数的高选择性有效的进行检测,即使LC 分离不充分，也可进行避开杂质影响进行定量分析。兼备分析对象和选择性好的特点。,LC,液质联用与气质联用的区别,气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，它的优点受到广泛承认。在物质分离、定性这方面GC-MS 是有效的手段，但是，可分析的试样只限分析小分子、易 挥发、热稳定高、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图， 可与标准谱库对比。 也就是说LC-MS 具有分析试样的适用范围广的优点。 液质联用(L
5、C-MS)主要可解决如下几方面的问题： 不挥发性化合物分 析测定； 极性化合物的分析测定； 热不稳定化合物的分析测定； 大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定； 没有商品化 的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。,现在，液相色谱质谱联用仪（LC-MS）已在制药、环境、食品、工业 材料等领域广泛使用。,LC-MS 的装置构成,质谱仪是由导入试样的HPLC 单元、LC与MS 的接口部分、试样离子化效导入生成离子的静电透镜部、将离子按质荷比m/z 分离的质谱分析部和检测被分离的离子的检测部构成。 根据离子化的不同有各种不同种类，这里展示采用一般LC-MS 检测器的大气压离子化四
6、极杆MS 的构成（图2）。在大气压离子化部分包括电喷雾离子源（ESI）、大气压化学离子（APCI）等，起到与HPLC 接口和离子源的作用。这里产生的离子，脱溶剂后通过八极杆等聚焦，导入四极杆。在四极杆上加直流与高频交流电压，只让具有目标m/z 的离子通过。将到达检测器的离子流转化成信号，在PC 上读取。,HPLC部,PC部,检测器,大气压离子化,进行MS/MS的仪器从原理上分为两类,第一类仪器利用质谱在空间中的顺序，是由两台质谱仪串联组装而成。 即前面列出的串列式多级质谱仪。,第二类利用了一个质谱仪时间顺序上的离子储存能力，由具有储存离子 的分析器组成，如离子回旋共振仪（ICR）和离子阱质谱仪
7、。但不能进 行母离子扫描或中性丢失。,仪器和工作原理简介,LC系统 接口和离子化方式 质量分析器 仪器的基本功能 离子极化方式 碰撞诱导裂解（CID） 扫描类型和扫描方式 LC-MS仪器组成框架图 真空系统 样品 液相色谱仪 接口 质量分析器 数据处理,LC系统,与传统的LC系统组成相同检测器 UV MS 色谱泵能在低流速下，提供流量准确、稳定的流动相 流动相不能含非挥发性盐类（如磷酸缓冲盐和离子对试剂） 流动相低浓度电解液和高比例有机相易获高离子化效率,接口和离子化方式,接口的作用 将流动相及其样品气化 分离出去大量的流动相分子 完成样品分子的电离 接口和离子化方式 接口的类型 传送带接口（
8、MB） 粒子束接口（PB） 直接导入接口（DLI） 连续流动快原子轰击（CFFAB） 热喷雾接口（TSP） 大气压离子化接口（API） ） 大气压离子化接口（API） （1）电喷雾电离（ ESI） （2）大气压化学离子化（ APCI） ）,（1）电喷雾电离（EPI）,流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘； 气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子 特点 ： 通常小分子得到M+H+ 、M+Na+ 或M-H-单电荷离子测定混合物；最软的电离技术，通常只产生分子离子峰； 生物大分子产生多电荷离子，其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子； 通过调节离子源电压控制离
9、子的碎裂（源内CID） 测定化合物结构。,大气压化学离子化（APCI）,样品液从由具有雾化气套管的毛细管端流出，经氮气流雾化， 通过加热管被气化 后经电晕尖端放电，溶剂分子被电离形成溶剂离子，然后雾化气和这些溶剂分子与气态样品分子反应，得到样品分子的准分子离子 特点 通常用于分析有一定挥发性的中等极性和弱极性 小分子化合物分析； 相较EPI对溶剂、流速和添加物的依赖性小； 适应高流量的梯度洗脱或高低水溶液变化的流动相； 通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。,质量分析器,双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector). 四极质谱仪(Q). 离子阱质谱仪（TRAP） 飞行时
10、间质谱仪(TOF). (TOF) 傅里叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS). 四极+TOF（Q-TOF） 串列式多级质谱仪三重四极（QqQ） (MS/MS) TOF+TOF,质量分析器,.四极杆质量分离器,质量分析器,1.四极杆质量分离器由四根平行的圆柱形电极组成，电极分两组，分别加上直流电和具有一定振幅和频率的交流电。当来自离子源的样品离子沿电极间轴向进入电场后，会在极性相反的电极间产生振荡。电极间轴向进入电场后，会在极性相反的电极间产生振荡。给定电压条件下，只有没m/z在某范围的离子沿间轴线做有限振幅的稳定的振荡运动 LC-MS (四极杆)联用仪器结构示意图,2.离子阱质量分析器
11、,特定m/z离子在阱内一特定轨道上稳定旋转， 改变端电极电压，不同m/z离子端电极电压，不同离子飞出阱到达检测器,3.飞行时间质量分析器,-270v 负高压,2.8kv 负高压,抽真空,试样 离子流,接 收 器,漂移时间,质量分析器,4.串联四极质谱仪(MS/MS) 三重四极（QqQ） 离子源第一分析器 碰撞室 第二分析器接收器 MS1 MS2 Q1 Q2 Q3 优点：质谱的化学噪声降低， 较单级分析有更高专属性和 灵敏度； 缺点：质量范围及分辨率有限，不能进行高分辨测定。,二 仪器的基本功能 离子极化方式 碰撞诱导裂解（CID）质谱 扫描类型和扫描方式,离子极化方式 ESI中正、负离子方式：
12、 中正离子溶液中预先形成的，酸性分子形成负离子，碱性分子形成正离子； 正离子检测方式下， 通常准分子离子以质子加合离子 或加合其他离子的形式存在。 离子极化方式 APCI中正离子方式： 中正离子方式 e + N2 N2+. + H2O H2O +. + H2O H3O+ + M APCI中负离子方式： 样品的准分子离子（M-H）-一般是OH-争夺 样品的准分子离子（ 一般是OH 质子而形成的 N2+. + e N2 + H2O +. H3O+ + HO. (M+H)+ + H2O,正、负离子模式的选择： 选择的一般原则为： ? 正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸 正离子模式： 对样品加
13、以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优 先考虑使用正离子模式。 ? 负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙 负离子模式： 胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性 基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负 离子模式。 碰撞诱导裂解（CID）谱 选择一定质量的离子作为母体离子进入碰撞室，室内 充有靶子反应气体，发生离子分子碰撞反应，从而 产生子离子，再经MS2的分析器及接受器得到子 离子质谱，称做CID (collision-induced dissociation)谱 碰撞气体：N2、He、Ar、Xe、CH4等 目的：裂解某一或某些特定的分子离子，给出其碎 片离子从而获得针对这一分子离子的
14、结构信息,扫描类型和扫描方式,扫描类型： 全扫描（full scan） 提供样品中每个分析物的全部质谱 选择离子监测（SIM） 用于痕量分析，专属性远高于SIM 扫描方式： 子离子扫描（product ion scan） 母离子扫描（precursor ion scan） 中性丢失扫描（neutral loss scan）,LC-MS 分析条件的选择和优化,1.接口的选择,2.正、负离子模式的选择,3.流动相的选择,4.流量和色谱柱的选择,5.辅助气体流量和温度的选择,LC-MS 分析 条件的选择 和优化,LC-MS 分析条件的选择和优化,1.接口的选择： ESI 适合于中等极性到强极性的化合
15、物分子，特别是那 些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子 （如蛋白质） APCI 不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极 性或中等极性的小分子的分析。 2.正、负离子模式的选择： 选择的一般原则为： 正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样 品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。 负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。 样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试 使用负离子模式。 3.流动相的选择 常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易 挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加
16、入易挥发酸碱如甲 酸、乙酸和氨水等调节 pH 值。 LCMS 接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含 钠和钾的成分必须lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵 塞喷雾针及污染仪器） 含甲酸 （或乙酸） 2。 含三氟乙酸0.5。 含三乙胺l。含醋酸铵10 一 5 mmol/l。 送样前一定要摸好 LC 条件，能够基本分离，缓冲体系符合 MS 要求。,4.流量和色谱柱的选择 不加热 ESI 的最佳流速是 150ulmin，应用 4.6 mm 内径 LC 柱时 要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm 内径的微柱，TIS 源最高允 许 lmlmin，建议使用 200400ul
17、min APCI 的最佳流速lmlmin，常规的直径 4.6mm 柱最合适。 为了提高分析效率，常采用 100 mm 的短柱（此时 UV 图上并不能 获得完全分离，由于质谱定量分析时使用 MRM 的功能，所以不要求各 组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。 5.辅助气体流量和温度的选择 雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。 操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言， 一般情况下 选择干燥气温度高于分析物的沸点 20 左右即可。对热不稳定性化 合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。 选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成， 有机溶剂比例 高时可采用适当低的温度和流量小一点的。,
