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1、第四章 酶的催化作用,酶催化反应动力学的内容和意义 酶催化反应动力学研究的是酶催化反应速度问题，即研究各种因素对酶催化反应速度的影响，并据此推断从反应物到产物之间可能进行的历程，在酶学研究和酶工程中具有十分重要的理论意义和广泛的实践意义。,酶催化反应动力学作为阐明酶催化反应机理的重要手段而得到了发展，它通过研究影响反应速率的各种因素，通过对各基元反应过程进行静态与动态的分析，从而获得反应机理的有关信息。,酶催化反应 单底物酶催化反应和多底物酶催化反应之分。 简单的酶催化反应动力学是指由一种反应物（底物）参与的不可逆反应，也称单底物酶反应动力学，它是酶反应动力学的基础，属于此类反应的有酶催化的水
2、解反应和异构反应。,催化动力学研究的简单历史 自19世纪末开始就有很多研究者致力与酶催化反应动力学的研究，并希望用合适的数学模型来描述酶催化反应的进程。,1902年Henri和Brown分别提出了酶催化反应中有酶-底物络合物的生成，并推导了简单的数学方程式，其中V.Henri首先进行了转化酶、苦杏仁酶和-淀粉酶等三种酶的催化反应实验，推测了其反应机理，并导出了动力学方程式，但遗憾的是从现在的观点来看，他的实验不够正确。,1913年Michaelis和Menten用简单的平衡或准平衡概念推导了单底物酶催化反应动力学方程，应用了所谓“快速平衡”解析方法对该速率方程进行了详细的研究，发表了著名的米氏
3、方程，即现在应用的Michaelis-Menten方程，常简称为M-M方程。,1925年Briggs和Haldane在酶催化动力学中引入了拟稳态的概念，对M-M方程的推导方法进行了修正。此后的单底物酶催化反应动力学研究大多都基于Michaelis-Menten或Briggs-Haldane方程。,从60年代初开始，人们已经开始尝试用平衡态或稳态概念来解释双底物甚至是三底物的酶催化反应，并建立了变构酶催化反应动力学模型。,许多学者对酶催化反应动力学进行了多方面的探索，使酶催化反应动力学的研究有了很大的进展。,对于从事酶应用的工程技术人员，除了需要了解酶催化的反应机理外，更应着重研究酶的总反应速率
4、，能定量解析影响总反应速率的各种因素，建立可靠的总反应速率方程氏，进而用于计算反应时间、最佳反应条件，以设计出合理的反应器。,酶催化反应的基本特征 酶是生物为提高其生化反应效率而产生的生物催化剂，其化学本质为蛋白质，少数酶同时含有少量的糖和脂肪。在生物体内，所有的反应均在酶的催化作用下完成，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密联系。,目前已知的酶多达2200种以上。作为生物催化剂的酶，它既有一般催化剂的共性，又应具有生物催化剂的特性。,1 酶的催化共性 酶参与生物化学反应，能降低反应的活 化能，加快反应的速率； 不改变反应的方向和平衡关系，即不能 改变反应的平衡常数，而只能加快反应达 到平衡
5、的速率； 酶在反应过程中，其立体结构和离子价态 可以发生某种变化，但在反应结束时，一 般酶本身不消耗，并恢复到原来状态。,例如，过氧化氢的分解，在无催化剂存在时，该分解反应的活化能为75.31kJ/mol，在用过氧化氢酶催化时，该分解反应的活化能仅为8.37kJ/mol。,2 酶的催化特性,(1)有较高的催化效率。酶的催化效率主要有以下几种表示方法： 酶的分子活力。在最适宜的条件下，每1mol酶在单位时间内所能催化底物的最大量（mol）。 酶的催化中心活力。在单位时间内，每一个酶的催化中心所催化底物的量（mol）。 酶活力或比活力。在特定的条件下，每min能催化1mol底物转化为产物时所需要的
6、酶量，称为一个酶单位，或称为国际单位，用U表示。酶活力还可用比活力表示，比活力指每1mg酶所具有的酶单位数，用U/mg表示。,1972年国际酶学委员会（Enzyme Commission, EC）提出，酶活力一律用katal为单位，记为kat，在特定条件下，每秒钟能催化1mol底物转化的酶量定义为1kat。而比活力则为每1kg酶所具有的数，即kat/kg。,酶的催化活性中心又称为酶的转换数,明显看出，酶的转换数大大高于化学催化剂，尤其在生理温度下更为明显。,(2)有很强的专一性 酶催化反应又很高的选择性，一种酶仅能作用于一种物质或一类 结构相似的物质进行某一种反应，这种特性称为酶的专一性或选择
7、性。 酶的专一性是酶作为催化剂最重要的特性，也是酶催化反应过程优于一般化学反应过程的最重要的理由之一。,酶的专一性 绝对专一性 相对专一性 酶的反应专一性,绝对专一性 一种酶若只能催化一种化合物进行一种反应，这种专一性称为绝对专一性。 例如脲酶只能催化尿素水解生成二氧化碳和水。,相对专一性 若一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应，称之为相对专一性。 如脂肪酶可以催化所有酯类化合物水解。,酶的反应专一性 若一种酶只能催化某化合物在热力学上可能进行的许多反应中的一种反应，这种专一性称为酶的反应专一性，具有不同反应专一性的酶只各自催化不同的反应。 例如，对同一反应物葡萄糖，
8、以葡糖氧化酶为催化剂可得葡糖酸；以葡糖异构酶为催化剂可得果糖；以己糖激酶为催化剂可得葡糖-6-磷酸。,一种酶只能催化一种底物，则称为酶的底物专一性。一种酶只能作用于所有立体异构体中的一种，则称为立体专一性。此外，还有官能团专一性、序列专一性等。,利用酶催化的这种高度的多种专一性，有可能制备出化学催化反应所不能得到的化合物，这也有利于提高产物的分离纯度。,(3)具有温和的反应条件 酶催化反应温度一般在生理温度2537的范围，仅有少数酶反应可在较高温度下进行。同时，酶催化反应一般是在接近中性的pH值条件下进行。,(4)酶易失活与变性 酶的化学本质是蛋白质，因而具有蛋白质的所有性质。其中容易变性的性
9、质使得酶在应用时常因变性而活力下降，甚至完全失去活力，即失活。,酶的变性多数为不可逆。引起变性的原因有物理因素及化学因素。 物理因素包括热、紫外线、射线、声波等； 化学因素包括酸、碱、表面活性剂、重金属盐等化学药品的影响。因而产生了诸如热变性、酸碱变性、氧化变性等。,此外，酶作为催化剂还存在着酶的提取工艺繁琐、成本昂贵、及目前大多数酶催化反应还只能在水溶液中进行的不足。,简单酶催化反应动力学,浓度,S0,S,ES,P,ES稳态浓度,t1,加酶后的时间,dS,dt,-,速度,S的消耗和P的形成的稳态速度,dPdt,dESdt,t1,加酶后的时间,前稳态动力学和稳态动力学,单底物 异构酶 A B；
10、 单向单底物 裂合酶A B+C； 假单底物 水解酶 A-B+H2O A-OH+BH； 双底物 氧化还原酶AH2+B A+BH2A2+B3+ A3+B2+基团转移酶 A+BX AX+B三底物 连接酶 A+B+ATP AB+ADP+PiA+B+ATP AB+AMP+Pi,酶催化反应类型,底物浓度对酶促反应初速度的影响底物浓度对反应初速度的曲线中间复合物学说对曲线的解释米氏方程式Km的意义，应用和求法 酶浓度对酶促反应初速度的影响 温度对酶促反应初速度的影响 pH对酶促反应初速度的影响 激活剂和抑制剂对酶促反应初速度的影响。,单底物酶促反应动力学,酶促反应的速度和影响因素,在低底物浓度时, 反应速度
11、与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。 当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,1 底物浓度对酶促反应速度的影响,1 Michaelis-Menten（MM）方程 推导 课堂练习!,（1）指出了S与V的关系 （2）指明了Km的定义 （3） Km不是ES的解离平衡常数，Km近似地表明E与S的亲和力。 Km大表明酶与底物亲和力弱， Km小则表明酶与底物亲和力强。 （4） Km是酶的特征常数。 （5）根据Km可判断酶的天然底物。,米氏方程的意义,米氏常数Km的意义,不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重
12、要的特征物理常数。 Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。,2 Briggs-Haldane方程 （修正的MM方程）,1925年Briggs和Haldane考虑到许多酶的催化常数很高，即 不能忽略，而且还发现很多酶的k2远大于k1。 对Michaelis和 Menton假设的第三条进行了修正，提出了“拟稳态”假说，对MM方程引入了更为普遍的假设。,“拟稳态”假说 认为由于酶反应体系在初始阶段底物浓度S要比酶的浓度E高
13、得多，中间复合物分解时得到的酶又立即与底物相结合，不断处于分解和生成之中，其生成和分解速度相等，从而使反应体系中中间复合物的浓度维持不变，即中间复合物的浓度不再随时间的变化而变化，即中间复合物的浓度达到了稳态，这就是“拟稳态”假说。,“拟稳态”假说的证明,Rapid Mixing Methods Relaxation Techniques,Briggs-Haldane方程的推导 课堂作业!,专一性常数 kcat/KM The Specificity Constant,The Ratio kcat/KM or the Specificity ConstantWhen the substrate
14、concentration is quite low, e.g. S KM,v = (kcat/kM)E0Sin this case, most enzyme will be free (unbound),E0 Eso v = (kcat/kM)ES,The Specificity Constant kcat/KM,Under these conditions, (kcat/kM) represent an effective 2nd order rate constant for the combination of free substrate and free enzyme, and t
15、hus provided an indication of the specificity of the enzyme for the substrate It can be used to describe the specificity of the enzyme for competing substrates,The Specificity Constant kcat/KM,The ratio of the reaction rates for low concentration of two competing substrates (A and B) is given by,The Specificity Constant kcat/KM,ExampleReversal of Substrate Specificity by Site-Directed Mutagenesisaspartate transaminase, AATase, catalyze-amino acid -keto acidIts preferred substrates are L-aspartate and L-glutamate,
