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1、,第七章 特殊毒理学,第一节 化学毒物的致突变作用,2,教学内容,基本概念和突变类型 致突变的机理 突变的后果 致突变性评价方法,3,教学目的 了解遗传学基础，致突变实验中存在问题； 熟悉DNA损伤的修复，机体对致突变作用影响； 掌握致突变类型、机制和后果，常用致突变实验的原理,教学重点及难点 致突变作用的概念 致突变作用的类型 致突变作用的机制 致突变作用的后果 Ames试验,4,1 概述（基本概念）,1、DNA,5,6,2、基因,9,3、染色质和染色体,10,11,12,4、细胞周期与细胞分裂 细胞从DNA复制起，经过分裂直到把DNA均等地分配到两个新的子细胞的全过程。,13,14,15,
2、16,5、体细胞与生殖细胞,17,体细胞 多是二倍体 损伤不会遗传给子代,生殖细胞 单倍体 突变可传给子代,6、遗传与变异,18,自发变异DNA的复制错误自发的化学变化,诱发变异射线化学诱变剂,19,7、致突变作用 外源化学物及其它环境因素能引起细胞核中的遗传物质发生变化，这种改变随同细胞分裂过程而传递的过程称为致突变作用,20,2 致突变作用的类型,21,突变,基因突变 (点突变),染色体畸变,染色体数目异常,碱基置换,移码突变,大段损伤,倒位,易位,缺失,重复,转换,颠换,插入,丢失,22,碱基置换,23,24,移码,25,大段损伤,大片段损伤是指DNA链大段缺失或插入。这种损伤有时可跨越
3、两个或数个基因，但所缺失的片段仍远小于光镜下所能观察到的染色体变化，故又可称为小缺失。,26,倒位（逆位）：染色体在某一片段的位置颠倒了180,27,易位（转座）：染色体的某一片段移接到另一非同源染色体上,28,缺失：染色体中某一片段的缺失,29,重复：染色体中增加了某一片段,30,卵圆眼,超棒眼,棒状眼,X染色体某一区段的重复，会导致果蝇由正常的卵圆眼变为棒状眼的变异，或眼睛更窄小的“超棒眼”。,31,染色体数目异常,32,3 致突变的机理,一、DNA的损伤 以DNA为靶的直接诱变 不以DNA为靶的间接诱变,二、DNA损伤的修复 光复活 切除修复 重组修复 SOS修复,33,（一）以DNA为
4、靶的直接诱变,（1）烷化剂的影响 烷化剂所致的碱基损伤可表现为错配。烷化剂提供烷基与DNA共价化合；烷化碱基引起DNA二级结构改变。,34,（一）以DNA为靶的直接诱变,（2）平面大分子嵌入DNA链 有些大分子能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间，称为嵌入剂(intercalating agent)。 它们多数是多环的平面结构， 易于嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间，造成移码突变。,35,（一）以DNA为靶的直接诱变,（3）碱基类似物的（base analogue）取代 取代后的碱基类似物出现异构互变,发生错误配对而造成碱
5、基置换。 例如：5-溴脱氧尿嘧啶（5-BU）取代T，2- 氨基嘌呤（2-AP）取代G。,36,37,胸腺嘧啶,38,（一）以DNA为靶的直接诱变,（4）改变或破坏碱基化学结构 有些化学物可对碱基产生氧化作用，从而破坏碱基的结构，有时还可引起链断裂。还有些物质可在体内形成有机氧化物或自由基，可间接使嘌呤的化学结构破坏，容易出现DNA链断裂。,39,次黄嘌呤,40,41,（一）以DNA为靶的直接诱变,（5）二聚体的形成,42,（一）以DNA为靶的直接诱变,（6）DNA加合物和交联分子的形成 亲电子剂极易与蛋白质或核酸等大分子物质中亲核基团（如SH、OH、N=等）发生共价结合，形成加合物或交联分子。
6、如苯并芘代谢产物与DNA形成的加合物分子巨大，使DNA构象改变，诱发突变。 亚硝酸、丝裂霉素C等使形成DNADNA交联使复制时不能解链，DNA复制和转录完全停止，细胞死亡。 烷化剂、苯并芘、砷化物、醛类化合物、一些重金属等与DNA的核蛋白交联形成DNA蛋白质交联物对DNA构象与功能造成严重影响。 DNA加合物的形成可活化癌基因，影响调节基因和抑癌基因的表达。,43,（二）不以DNA为靶的间接诱变,主要涉及细胞分裂过程的改变如纺锤体、微管蛋白的合成与聚合，微管结合蛋白的合成与功能发挥，细胞分裂纺锤纤维的功能发挥等。,44,1、纺锤体抑制,（1）与微管蛋白二聚体结合（2）与微管上的巯基结合（3）破
7、坏已组装的微管（4）妨碍中心粒移动（5）其它,45,2、对DNA合成和修复有关的酶系统作用,对DNA合成和复制有关的酶系统作用也可间接影响遗传物质。 例如，一些氨基酸类似物可使与DNA合成有关的酶系统遭受破坏而诱发突变；铍和锰除可直接作用于DNA外，还可与酶促防错修复系统相作用而诱发突变。 修复过程中的酶,46,复制,47,切除修复,48,4 突变的后果,体细胞突变 仅影响接触致突变物的个体，不影响下一代。 肿瘤、畸形、动脉粥样硬化、糖尿病及衰老等。,生殖细胞突变 可影响下一代，甚至人类的基因。 基因突变对人类的影响程度分为五类。,49,对机体无影响，如同义突变； 导致对健康无影响的正常人体生
8、化组成的遗传学变异； 导致遗传易感性的改变； 导致遗传性疾病； 致死性突变，造成配子死亡、死胎及自发流产等。,50,先天性疾病都是遗传性疾病吗？,5 化学毒物致突变作用的研究方法,51,基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此将试验观察到的现象所反映的各种事件称为遗传学终点。 遗传学终点分为：基因突变、染色体畸变、DNA损伤等其他遗传损伤的检测,52,一、主要致突变实验,53,基因突变,微生物,哺乳动物细胞,果蝇,哺乳动物,植物分
9、析,染色体畸变,哺乳动物细胞,果蝇,哺乳动物,真菌,植物,54,1、细菌回复突变试验,美国加州大学的Ames教授在1979年建立并完善，又称Ames试验（鼠伤寒沙门菌/组氨酸回复突变试验）。,55,（1）什么是细菌回复突变试验？ 以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体外试验。 常用的菌株有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌。,56,（2）鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验原理,57,鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+),组氨酸营养缺陷型突变株(his-),受试物, 代谢活化系统,利用若干不同基因型组氨酸缺陷型菌株，每个菌株具有其独特的回复突变“靶点”顺序，可以由不同类型
10、的碱基置换和移码诱变剂诱发回复突变。该菌株在无外源性组氨酸供给的情况下不能生长繁殖，但当发生回复突变时则可在无外源性组氨酸供给的情况下生长繁殖，计数诱发的恢复菌落数即可判断化学毒物的致突变性。,代谢活化系统一般是S9混合液。S9即将一组雄性大鼠进行腹腔注射芳香族化合物如多氯联苯油溶液等诱导大鼠肝脏酶系的活性，4d后杀鼠取肝脏，匀浆，经9000g离心得到的上清液。再加入一些辅助因子，如辅酶(NADP)、葡萄糖-6-磷酸，K+Mg+及缓冲液等组成S9混合液(S9mix)，构成NADPH再生系统。,58,（3）Ames法原理的依据 化学物质引起的诱变往往不是直接的，它要经过生物的消化、吸收，特别是高
11、等生物肝脏中的有关酶的作用后再起作用，也许它本来是可以起到诱变作用的，但经肝脏中酶作用后失去了诱变能力，也许正好相反，相来它不具有诱变的能力，但经肝脏酶作用后，反而获得了诱变的能力，因此经过肝脏中酶的作用才能较真实地反映在动物活体中某种化学物的实际诱变能力。 诱变剂仅改变突变的频率，但不改变突变的方向，那么同样诱变剂也能导致回复突变，如果用正突变的话是多方向的，所以必需采用反方向的选择方向才行，而用回突变只需用基本的培养基进行筛选即可，步骤就要简单的多。,59,（4）测试菌株 TA 98、TA 97（检测移码突变） 、 TA100（检测碱基置换突变）及TA102（对醛、过氧化物及DNA交联剂较
12、敏感）等。 测试菌株含有组氨酸基因突变（his），脂多糖屏障丢失（rfa），紫外线切除修复系统缺失，抗药性标记R。,60,（5）Ames检测方法,61,优点:方法灵敏，检出率高，经试验有90的化学致癌物经都可获得阳性结果；加之方法比较简便、易行，不需特殊器材，容易推广。 缺点:微生物的DNA修复系统比哺乳动物简单，基因不如哺乳动物多，不能完全代表哺乳动物的实际情况。 尽管如此，由于存在着上述的优势，故目前在致突变试验中占重要位置，为首选的试验方法。,（6） Ames试验的优缺点,62,2、哺乳动物细胞基因突变试验,体外培养细胞的基因正向突变试验。原理是在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞
13、暴露于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，突变细胞在含有6硫代鸟嘌呤或三氟胸苷的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。突变频率是指观察到的突变细胞数与存活细胞数的比值。,63,3、果蝇伴性隐性致死试验,原理：根据隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传特征，即雄性的X染色体传给F1代雌蝇。又通过F1代传给F2代雄蝇。X染色体的隐性突变基因在F1代为杂合体，不能表达，而在F2代雄蝇为半合体，能表达出来，如果雄蝇接触受试物后X染色体出现隐性致死性突变，结果其F2代雄蝇数目较雌蝇少一半。由此推断致死突变的存在。,64,4、转基因动物致突变试验,转基因动物指基
14、因组中整合有用实验方法导入的DNA(可以是完整的基因，也可是不完整的DNA片段)，并能遗传给后代的一类动物。目前，用于致突变作用研究的转基因动物主要有商品化的BigBlue小鼠和MutaMouse小鼠。 转基因动物致突变试验时，染毒后先抽提纯化不同器官或组织的基因组DNA，把纯化的基因组DNA与噬菌体体外包装抽提物混合，而将导入的基因载体包装进噬菌体中，用这些噬菌体感染大肠菌，可形成噬菌斑，通过噬菌斑颜色变化进行突变的判断并获得突变子。,65,5、染色体畸变分析试验,体外染色体畸变分析试验(in vitro )常用的分析细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、中国仓鼠肺(CHL、V79)细胞及外周血
15、淋巴细胞等。 体内染色体畸变分析试验主要有啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变和骨髓细胞染色体畸变试验。 染色体结构异常主要可观察到裂隙、断裂、断片、缺失、微小体、着丝点环、无着丝点环及各种辐射体等。 染色体数目异常包括多倍体及非整倍体。,66,67,6、微核试验(micronucleus assay),微核试验是通过观察有微核的细胞率()，用于检测DNA断裂剂及非整倍体诱发剂。 用于微核检测的细胞很多，现已建立了植物细胞(如蚕豆根尖等)、哺乳类动物细胞(如骨髓细胞、肝细胞、肺细胞、淋巴细胞、红细胞、精子等)、非哺乳类动物细胞(如鱼红细胞、蟾蜍红细胞等)的微核试验方法。,68,7、程序外DNA合成试验
16、,当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在正常复制合成期(S期)以外的其他时期，称为程序外DNA合成。 用同步培养将细胞阻断于Gl期，并将正常的DNA半保留复制阻断，然后用受试物处理细胞，并在加有3H-胸腺嘧啶核苷的培养液中进行培养。如果受试物引起DNA损伤，并启动DNA损伤修复机制，培养液中的3H-胸腺嘧啶核苷就会掺人到DNA链中。利用放射自显影法或液闪计数法测定掺入DNA的放射活性，检测DNA修复合成，从而间接反映DNA的损伤程度。许多哺乳动物及人类细胞可用于UDS的检测。,74,8、姐妹染色单体交换试验,在DNA合成期，所有染色体均进行复制，复制后形成两条姐妹染色单体。姐妹染色单体交换(sister chromatid exchange，SCE)可能与DNA的断裂和重接有关，故可间接反映DNA损伤。 SCE的观察方法是采用姐妹染色单体的差别染色,在细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)，5-BrdU是嘧啶类似物，在DNA合成期可与胸苷竞争掺人DNA中。DNA复制是半保留复制，经过一次有丝分裂后，5-BrdU掺入后，对染料的亲合力下降，染色后会出现一深一浅两条姐妹染色单体。如果有交换发生就可在光镜下计数SCE。,
