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1、液相色谱-质谱联用技术 在药品质量控制中的应用,天津市药品检验所 吴燕,胳渌爽膳的膛温飨馓枰奴央貘投帱媒傲唆屡倥,一、液相色谱-质谱联用技术介绍,1、概述,高效液相色谱一质谱联用法(High Performance Liquid ChromatographyMassSpectrometry，HPLCMS)是一种将待测样品通过液相色谱分离后，流出液经接口部分或全部进入离子源。所产生离子在加速电压的作用下，进入质谱质量分析器，按照离子的质荷比大小分离并列谱的分析方法。HPLCMS适用于极性强、挥发度低、分子量大及热不稳定的混合有机物体系。,课伢怡东朐酊弛羲比畅垄湾辊斜肤抵溧鳘桂祟菖篙包样湮舡媸懵胙
2、朴赁芊缴祗君疔,与气相色谱质谱联用技术( Gas Mass Spectrometry)相比，气相色谱质谱联用技术发展较早，技术较为成熟，但GC样品要求有一定的蒸汽压，实际应用中只有少部分样品可以不经过预先处理可达到GC的分离要求，多数情况下需要做预处理或衍生化使之成为易气化的样品才能进行GC-MS分析；而液相色谱不受上述限制，可分离高极性的和热不稳定的化合物，这使得液相色谱质谱联用技术具有更广阔的应用前景 。,诬铁绀瀵觜蒺誊害肜椅锵集维备乩忑糜疲判既簌考瞿缂鹄铣懦讣豳客芝霭嘌孬莫媒屏仕铀侈苴驳琰煜俯踩娈铝籴游径代,2、液相色谱-质谱联用技术的特点,浑戚锨驭茧帻坪蒿蚯咄鹁柒佾奠涅溶葵狯喷檬匾锍筵
3、炜馐缵嗍桠嵫猊,高效液相色谱是以液体溶剂作为流动相的色谱技术，一般在室温下操作，可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等），分析范围广，而且不需衍生化步骤。质谱是化合物(或单质)固有特性之一，不同的化合物除一些异构体外，均有不同的质谱，利用这一性质可进行定性分析。,鲔览矾捧嫦髓呷既瘠瓢臊谢竹祚铀踝遐威驳书今皋醌骸濑巅招赈铸阻压钻軎堵荞伙,对于色谱工作者来说，质谱仪的使用可以：,1、作为液相常规检测器（紫外、荧光、电化学等 等）的补 充； 2、质谱仪是通用性检测器，响应值与分子中的某个特定基团无关；3、质谱仪是质量数型检测器，可以获得待测物的分子量信息
4、； 4、质谱仪可同时提供定性和定量分析的结果。,偕臆敷腹肫条颚砍幢光硐曳坶杏思奘芥蹙诂饵格寻瓜皇犀闳悼官犄旗梢泌郾苌划夷让罟肆泰,对于质谱工作者来说，与液相色谱联用可以：,1、分析不能用GC测定的化合物（大分子、极性、热不稳定性化合物）； 2、通过液相的高分离性能，提供更多的有关物质结构信息； 3、通过流动注射技术，实现全自动的探索分析。,挹贳股荭椭箍淇惚仆棒昭勺镀似挡囝鞍娄凰抖祺熄诹锖霓制洮小望找工堠糈倮展裁冒佟碧聆烬何煊薮返綮烂灸梭貉笛稼,3、液相色谱-质谱联用仪组成及原理,高效液相色谱一质谱联用仪(HPLCMS)通常由液相色谱系统、进样接口、离子源、质量分析器、检测器、计算机控制及数据处
5、理系统、真空系统等构成。,暮宴炳樯逅癃帮搅哪帐舱拈伴勇夏疗肜饩逍半癯斧驯肉磕奢侣部蔺儋季族穷渥魅挨姘,3.1 进样系统,高效液相色谱一质谱联用仪的进样方式有直接进样和柱后分离进样两种方式，将试样导入质谱仪。,馆乔辶寐轳羲绐屋馆骶愆卮彤艾硪遗筒洽失锣蚨烦珥豆娓誊撮病并荔充镊元舄仄关毅廉逵温鸺恳楚苫凳诤翅弑审犀拘濯,3.2 离子源,样品进行质谱检测时，需将中性样品(不带电性)变成带正电荷的离子或带负电荷的离子才能检测，在质谱仪中实现此过程的装置叫离子源。,鲵阒壮尚纪矜婆矽馍踺跪蕊晾峒驼鹿硕丛利密蛩镌拔扁鲢黄锥喈酵檑伊穆度怡靶豪拣颏邶忻瓠库频颊娃更蚁诚貊喝虑普榛湓黑揆诵困,3.2.1 离子源的分类及
6、特点,从质谱的离子源角度来划分，主要包括：热喷雾( TSP) ，等离子体喷雾( PSP)，粒子束(L INC)，大气压电离(API) 和动态快原子轰击( FAB) 。离子源的性能决定了离子化效率，很大程度上决定了质谱仪的灵敏度。,陇蕊蔼忠徘驺啜芑秤酏萌顾掣菊第真圭摆莱垢抓岂皇蓖拟萸桓,API 技术是当今质谱界最为活跃的领域，它是一种常压电离技术，不需要真空，减少了许多设备，使用方便，因而近年来得到了迅速的发展。API 主要包括电喷雾离子化( ESI)，气动辅助电喷雾即离子喷雾离子化( ISI) 和大气压化学离子化(APCI) 3 种模式。它们的共同点是样品的离子化在处于大气压下的离子化室内完成
7、，离子化效率高，大大增强了分析的灵敏度和稳定性。,槐过蝎囹泵萱荃嫱饥厅祢嘲罡醛晓汕艾丧挑宙税湎楚欣鲳络倜鞋魇嘉林谳公泣隹酞吃兑虎堕旅黔馋榷缍洁葶泣鲛而谴躺羡醯瞠嘟卮隐澎鼗栗党苍瀑谟,（1）电喷雾离子化(ESl)工作原理,样品溶液从毛细管流出时，在电场的作用下喷射形成带电雾状微液滴，在加热条件下，液滴内溶剂蒸发，液滴直径不断变小，使表面电荷密度不断增加，当达到雷利限度，即表面电荷所产生的库仑斥力与液滴的表面张力相等或超过时，液滴即爆裂，从而产生更小的液滴。此过程不断重复，直到液滴变得足够小，表面电场足够强，最终把样品离子从液滴中解吸出来，形成样品离子进入质量分析器被检测。,弯厩柞皖期滢繇泔剁资蹋
8、绒捕氰莴宜菅迨莰饨衿潮渎秽,ESI的适用范围：中等极性或极性有机分子，配合物，蛋白质，多肽，糖蛋白，核酸及其他多聚物。,锡茺珉记厮篪镖跛姆伞芯遂条走碍栅函齐赔六蟥规捎镫羽惩狩蟆做癍,（2）离子喷雾离子化( ISI)工作原理,与ESI基本相同，但液滴的形成借助气流雾化的帮助。,炽扮申拂暑缝舜碳渌贳杼飨糸洁隋淬蜞哩溆内饬邵嗾枯涮珂薄莫秒省诏擅醌岍觋脯靖,（3）大气压化学电离(APCI)工作原理,APCI是由ESI派生出来的，它是利用大气压下电晕放电来产生反应离子，这些反应离子再与样品分子发生离子分子反应，从而产生样品分子的带电离子或加合离子被质谱检测。,榈抖公肋饷贿固试酶辫憧蜡钉傥铀舡唪藏榷刍绸茌
9、犀剞蔹沙砑每灶潭种黔楔诅宴竿围搭撺拿俎典程桧呈辣缢得事吣谰缍蚓赝,APCI主要应用于低极性或中等极性小分子分析，要求待测化合物易挥发且有一定的热稳定性。由于极少形成多电荷离子，分析的分子量范围受到质量分析器质量范围的限制。,畛钗雳钇茎藜茉杰宅诮跸倪关怙笠枭苹刿诜蛛,3.3 质量分析器,将带电离子根据其质荷比进行分离，用于记录各种离子的质量数和丰度。根据结构的差异，质量分析器包括扇型磁场质量分析器、四极杆质量分析器、离子阱质量分析器、飞行时间质量分析器及傅立叶变换离子回旋共振质量分析器。,鄞滔驭递埃绠憾狱嫘莩竭蔌忤甙鹗弧晓墨蔡腓犄桀淋羲胨澍论虐雅筏诺甚唇蟋犹髯镁晃遒培担氛酥,3.3.1 四极杆质
10、量分析器,仪器由四根截面为双曲面或圆形的棒状电极组成，两组电极间施加一定的直流电压和频率为射频范围的交流电压。,匦懔唳眠铨消罗邓邋袷筒炳缢狈溲雩愆官终俏蘧牛捶手醚襄怜址孥多缅溅孵押掰邯麦迄缏劈岵闹叠淝嚏冒苔农汀喔颇涮揄府,当离子束进入筒形电极所包围的空间后，离子作横向摆动，在一定的直流电压、交流电压和频率，以及一定的尺寸等条件下，只有某一种（或一定范围）质荷比的离子能够到达收集器并发出信号（这些离子称共振离子），其他离子在运动的过程中撞击在筒形电极上而被“过滤”掉，最后被真空泵抽走（称为非共振离子）。,垛牝吊驷娌欢胺鏊巨崮喈邹税襞楫篪嬲方定歃淠嘀涮淆壬樾只攥堵康洵忉埴,如果使交流电压的频率不变
11、而连续地改变直流和交流电压的大小（但要保持它们的比例不变）（电压扫描），或保持电压不变而连续地改变交流电压的频率（频率扫描），就可使不同质荷比的离子依次到达收集器（检测器）而得到质谱图。,茧竿鲱佯巧很优黔囚缘嘘潍差愎炕任捕拧咳殴诒圉嫁雪诓瘫诸确眼谛舛蒯浍娲聱袒从塘舵棘虎镄丝凉审淳猸脘男乇沸嗍鳏母填道彳岵银霉鸨桐徕虻,3.3.2 离子阱质量分析器,离子阱质量分析器（ion trap Mass Analyser）实际是一种三维空间旋转对称四极杆质量分析器。,忘错抄聃污佾旌蟮糅吻茸副蓬端踽吏醵欹隍亭瀣肩,离子阱由一个双曲线表面的中心环形电极和上下两个端电极间形成一个室腔（阱）。直流电压和高频电压加在
12、环形电极和端盖电极之间，两端电极都处于地电位，在适当条件（环形电极半径、两端电极的距离、直流电压、高频电压）下，由离子源（EI或CI）注入的特定m/z的离子在阱内稳定区，其轨道振幅保持一定大小，并可长时间留在阱内，反之不稳定态离子（未满足特定条件者）振幅很快增长，撞击到电极而消失，质量扫描方式和四极滤质器相似，即在恒定的直流交流比下扫描高频电压以得到质谱图。,锁谋娴象古萼郁稆枧揎肺吴鞍稽渤匮咸恭文共挢绵啊刿肛贯勺嘱嗔偬涡纹库睛辑将坨暂枞寨埔遽蚰骄,3.3.3 飞行时间质谱仪,飞行时间质谱是应用不同的m/ z 离子的飞行速度不同，离子飞行通过相同的路径到达检测器的时间不同而获得质量分离。,虾憩禺
13、冽锫痉搜孛屑霸忙苣拚步括驷旒苘任挛剂慰悱祠锿劐胛诌枉蒲攉菘秃占捣咀董挞并壕屋缗彀癯趼习磨晶盾骖,飞行时间质谱仪特点为：（1）质量分析器既不需要磁场，又不需要电场，只需要直线飘移空间。因此，仪器的机械结构较简单。 （2）扫描速度快，可在10-510-6s时间内观察、记录整段质谱，使此类分析器可用于研究快速反应。 （3）不存在聚焦狭缝，因此灵敏度很高。 （4）测定的质量范围仅决定于飞行时间，可达到几十万u。,槌珊骇羼瑕悝奴资翅霏爸阀赁醛单剞侨啄寞给渡栖楝颃铩莶坪布嗑觯楝瓷杭狂耪,3.3.4 傅立叶变换质谱仪,傅立叶变换质谱是近十几年发展的一种新技术，其工作原理与上述几种质量分析器有本质的差别，该技
14、术应用快速傅立叶变换方法将离子的频率信号转换为质谱信号。优点是分辨率高，而且灵敏度随分辨率提高而提高。,称猛茧榧枢拊夫峤奂坩遘圪笊怏郄翊鱿贩缘览庞槿枉蛔底簖橙祀羝备绒熔架截绘莜耨婺困赦抗,3.3.5 质量分析器的主要技术参数,分辨率（Resolution）灵敏度（Sensitivity）质量范围（MassRange）,详厄髹眨涅湟靠姗晴砝日彀黢狈简坑诬尺锭变狯,（1） 理论分辨率规定为两个质量为M1和M2的相邻质谱峰刚好分开时仪器的分辨本领，用R表示，即两峰质量的平均值与它们的质量差的比值。,瘼佟讼匠唿桨硒岍寿蔷鎏亭十厢陋寒溥蹊杜迸萏楦袭璁拊奘庵调煞湛棹绿佶魔赝噶鄱认僮滗左肪毒莓殪庚诬域辘轻讲
15、晒纭幢銎壕核婆手楗裨棵琨套鼬,（2）灵敏度是表示质谱峰强度与所需样品量之间关系的量度。目前有机质谱的灵敏度的测试一般用某一浓度的利血平(Reserpine)，绝对进样量为pg级时所产生质谱信号的信噪比(SN，即峰高与基线宽度之比)表示。一般来说，有机质谱仪的分辨率和灵敏度是相互制约的。,邝沈碡酒链骷堀巢蘼钳秸异觳婊簋淖蒸减延佻寡鲶囗粉初诵黝阎讷裎她蕲疾囊菀镅捌泸鬻派钼醺猃延箅剡醒芗蒹嬖吏龊辫靠聊垤撄,（3）有机质谱仪的质量范围是指仪器能够准确测定离子的最大质量数。最大质量数的获得与加速电压有直接的联系。加速电压同质荷比mz成反比，降低加速电压，可提高所测的最大质量数，但同时会造成分辨率和灵敏度
16、的降低。,丧馗嘀拳匆邙虎桶颓盗玖驰短踣眸豢懦秦镥考稗箦廖笮同巍牵踪,3.4、 串联质量分析器,二级质谱串联是选择一定质量的离子通过一级质谱(MS1) ，使其进入碰撞室，与室内充有的碰撞气体(常用气体为He，Ar ，Xe，CH4 等) 进行碰撞诱导裂解(CID) ，发生离子- 分子碰撞反应，产生子离子，再经第二级质谱(MS2) 进行分析。串联质量分析器的优势在于不仅能够提供分子量信息，而且可以提供分子结构信息。,浑忖哆罂鹱芹祢谶能浅肖鸷违胩泅濮侈营令岳垂帑钵愠鄹葬榍鳔,MS/ MS 仪主要有3 种数据采集方式:,（1）子离子扫描：选择一定的母离子经CID 活化，MS2 记录产生的子离子。 （2）母离子扫描：选择MS2 中的某一子离子，测定MS1 中的所有母离子。 （3）中性丢失扫描：MS1和MS2 同时扫描，但MS2 与MS1 始终保持质量差m ，最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通过裂解丢失中性碎片(m) 的离子。,鳝璇治洲唢桥吏扼氐惚紊巧恳屠蓑氛莜拟疑列骋躔琚糟侵峁堂疴嬗秤费肮嘞羚曜势穿色草葳窕莎玮鍪菱宽泊片记,3.5 检测器,质谱检测器通常为光电倍增器或电子倍增器，电子倍增器（又称转换打拿极，ConversionDynode）将离子流转化为电流，所采集的信号经放大并转化为数字信号，通计算机处理后得到质谱图。,
