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1、第二章 研究细胞的方法,第一节 显微镜技术,一、显微镜与分辨率1.明视距离：物体在人眼视网膜上成像的大小和 物体与眼睛的距离有关。物体离眼睛 的距离越近，视网膜上的物像就越大，但眼睛的曲光度就随之增大，眼部肌肉就越发疲劳。经测试在物体离人眼25cm时，看物体又清楚，眼肌也不疲劳，因此把人眼正常工作距离定为25cm，称之为明视距离。,2、分辨力和光镜的分辨极限分辨力（Resolution）：又叫分辨本领，是指将邻近两点清晰区分辨认的能力。,分辨极限（Limit of resolution）对可见光来说，能清楚分辨出相邻两点之间的最小间隔为0.2m。R 0.61 / n .sin 0.610.5
2、m / 1.51 0.2 m,数值孔径N.A（ n .sin ）,数值孔径的大小代表了光镜的会聚能力。数值孔径越高，光镜的分辨力越大，所呈影像的亮度越强。,二、光学显微镜技术,1、普通光学显微镜技术,显微镜结构： 机械部分：镜座、镜柱、镜臂镜筒、调焦装置、载物台（物镜转换器） 照明部分：反光镜、聚光镜 光学部分：目镜、物镜放大倍数：目镜的放大倍数物镜的放大倍数,2、生物样品制备的过程 固定：可使生物大分子交联，蛋白质成分凝固，防止细胞自溶和破坏而产生人工假象。常用固定剂：甲醛、戊二醛、乙醇 包埋：为了便于切片，防止样品移位 常用包埋剂：石蜡, 切片：由于生物样品太厚，不能直接用光镜观察，需切成
3、110m的薄片, 细胞不同成分的选择性染色： 细胞总重量的70是水，对可见光来说几乎是透明的，因此未经处理的细胞在普通光镜下几乎是看不见的，为使细胞成为可见的常用方法就是染色常用的染料：苏木精对负电荷分子有亲和力，可显示细胞内核酸的分布伊 红可使细胞质染色,人皮肤组织切片照片（苏木素、伊红染色）,3、荧光显微镜技术(fluorescence microscopy)是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。,荧光（Fluorescence）：细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照射后能发出可见光线，称为荧光。自
4、发荧光：由细胞本身存在的物质经紫外线照射后发出的荧光。诱发荧光：一些细胞成分本身经紫外线照射后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、 吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱发荧光。,荧光显微镜的基本构造,4、相差显微镜技术只有光线通过染色标本时其波长、振幅发生变化，人眼才能看见，但活细胞和未染色的标本由于光波长和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化，因此利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。,相差显微镜比普通光镜多了2个部件：1）在聚光器上增加一个环形光阑；2）在物镜
5、后焦面增加一个相板，相板上有一个环形区，通过环形区的光比从其它区域透过的光超前或滞后14，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。,光波的干涉,光波的衍射,光通过标本致密区时发生衍射，产生偏折光，相位和未受影响的直射光相比被推迟了14。只有未发生偏折的的直射光可通过相位板的环形区，其它的偏折光在物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板的环形区的光不同的14的光程差。两组光在平面上成像。如相板的环形区使直射光超前14，加上开始直射光超前的14，直射光共超前12 ，直射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。,如相板的环形区使直射光滞后14，加上开始直射光超前的14，两者相抵直射光不
6、发生变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增加，产生明反差。结果未经染色的活细胞内的各种组织就可显现不同的明暗对比。相差显微镜可观察活细胞的各种活动，如细胞迁移、分裂，运动等。,5、共焦激光扫描显微镜技术 （Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM）,共焦激光扫描显微镜技术是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。共焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的
7、点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。,在显微镜载物台上加一个微量步进马达，使载物台上下移动，改变焦平面，不同层次的光切面图像经计算机图像三维重组，就能获得样品的立体结构图像。,三、电子显微镜技术,光镜分辩极限为0.2m，小于0.2m的微细结构的光波可产生衍射现象,这种光波经过物体时可绕过物体就象无物体经过一样,因此无法用光镜观察。这就需要一种更大分辫力的仪器来观察比0.2m更小的物体的微细结构。,电子波长比光波短得多,用电子波代替光波可提高显微镜的分辩力。电镜就是根据这样的原理产生的。,电子显微镜分辨率,
8、电子显微技术中的常用度量单位是埃（） （ 1=10-1nm=10-4um=10-7mm=10-10m ） 此图中相邻两个原子之间的距离是2 ,电镜的历史,1938年 Ruska 生产出第一台透 射电镜,电镜的历史,1935年 法国的卡诺尔提出扫描电镜的设计思想和工作原理。1942年 剑桥大学的马伦首次制成世界第一台扫描电镜。,一、分类：透射电镜 （Transmission electron Microscope TEM）扫描电镜 （Scanning electron Microscope SEM ）,1、透 射 电 镜,1）、透射电镜标本制备过程:取材:尽可能保持生活状态,避免损 伤必须耐真空
9、由于电子穿透力弱,标本必须超薄标本反差应尽可能大(生物材料原子系数低,图像反差差,不易出现明暗差别),固定:为防止生物样品在死亡后和脱水 过程中产生结构改变,离体生物标本迅速固定。常用戊二醛和四氧化锇固定戊二醛在蛋白质分子之间形成共价键,将它们交联在起。四氧化锇除与蛋白共价结合 外,还对脂类有良好的固定效果。,脱水:标本必须置于高真空中进行电镜观察,但 电镜不能观察含水的生物标本，因此需经脱水处理。另外由于包埋剂与水不溶， 用脱水剂可将组织中游离水脱去，有利包埋。 包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、电子轰击,则在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。 切片:电子穿透力很弱,
10、需将样品制成50100nm厚的薄片。 染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成,.它 们散射电子能力弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,为加大生物样品反差,进行染色。常用的染色剂：醋酸铀、枸橼酸铅。,2）、提高样品反差的方法,负染法(negative staining) :将病毒、纤维、核糖体或分离的生物大分子样品放于覆有亲水性支持膜的载网上,滴加磷钨酸,样品干燥后重金属盐沉积于样品周围使样品和背景形成显著的明暗对比,这种染背景而不染样品的方法叫负染。,真空镀膜法(meta1 shadowing):把铂或钯等重金属接受高温蒸发,金属颗粒以一定倾斜角度喷落在样品表面形成不同厚度的薄膜,膜的厚度反映了样
11、品的表面轮廓，主要观察病毒、噬菌体或大分子的形状。,整装细胞电镜技术:应用高锰酸钾固定剂,将细胞中大部分蛋白质性结构破坏,而内质网等膜性细胞器保存下来。这样不需超薄,细胞中的内质网膜系统及高尔基复合体、溶酶体和线粒体等膜性结构就能显现出来。,冷冻蚀刻复型电镜技术 (freeze etching rep1ica e1ectron microscopy)将标本用液态超低温冷冻,真空中割断,升温使冰升华,细胞内外凡含水多的地方因失水而下陷,膜和其它一些结构显露出来,增强了断面的浮雕效果蚀刻。 标本蚀刻后以45喷金,90喷碳后将组织溶解掉,剩下的碳-金属膜就是复型。将复型膜置于透射电镜下观察,可观察蚀
12、刻面所暴露的各种微细结构。,冷冻：制冷剂（一般为液态氮）快速冷冻，使样 品固定。 断裂：在低温真空中将样品劈开，断裂面上可见各种细胞内结构,蚀刻：升温使冰升华，细胞内外含水多的地方因失水而下陷，膜和其它结构显露出来，增强了断面的浮雕效果。,复型：以45喷铂金，90喷碳固定，显示立体结构 剥膜：将样品取出，浸泡于腐蚀夜中将生物组织腐蚀掉，只剩下铂碳复型膜，捞于载网上干燥后透射电镜观察,二、扫描电子显微镜,scanning electron microscope,扫描电镜照片展示,注射针头的扫描电镜照片,扫描电镜照片展示,不同倍率的果蝇扫描电镜照片,扫描电镜照片展示,可以用计算机将黑白照片处理成彩
13、色,扫描电镜照片展示,肺细支气管粘膜杯状细胞和纤毛细胞扫描电镜照片,扫描电镜照片展示,红血球,扫描电镜照片展示,培养细胞,扫描电镜的成像原理,扫描电镜的特点,高的分辨率,扫描电镜的特点,很强的立体感,扫描电镜的特点,放大倍率范围广,扫描电镜的特点,样品适应性大,应用范围广,扫描电镜生物样品的制备,SEM所取得的迅速发展表明，仪器本身性能（如分辨力、多功能等）的不断提高固然重要，但样品制备技术的改良和日趋完善，则对SEM的应用与发展确实起到了积极促进作用。同时，样品制备的质量如何，也是能否发挥SEM仪器最佳性能、拍出理想图像照片的关键所在。因此，SEM生物样品制备技术问题，一直是电镜工作者不断创
14、新的一个重要领域。,扫描电镜生物样品的制备,一、 SEM生物样品制备的基本要求生物样品与金属、矿物等材料不同，它具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低以及含水量多（有的含水量达 80%以上）等特点。因此，在处于高真空状态下的扫描电镜内观察生物样品时，必须严格地遵循一定的原则和操作程序，对样品进行必要的预处理。,扫描电镜生物样品的制备,在进行SEM样品制备时，一般应掌握以下原则：(一）每一处理步骤及操作过程中，都应注意防止对样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能地保持原有形貌及微细结构。 （二）去除样品内的水分，以利于维持SEM的真空度和防止对镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽
15、量避免和减少样品体积变小、表面收缩变形等人工损伤。 （三）降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适当的反差和减少样品的充放电效应。（四）无论观察组织、细胞的表面或内部微细构造，都应注意辨认和保护观察面。,生物样品制备的基本操作程序,临界点干燥法的工作原理,临界点干燥，是根据物质存在着临界状态的物理特性而研制的。在温度和压力的变动之下，任何物质存在的固态、液态和气态三种形式都可以相互转化。实验证明，当温度、压力达到一定的数值时，气体的密度可增大到与液态一样，此时气相与液相的界面消失，液体的表面张力亦会随之消失，物理学中，将上述情况称为临界状态，将此时的温度和压力，分
16、别称为临界温度和临界压力。临界点干燥，就是利用物质在临界状态下液体表面张力被消除的特性，克服样品干燥过程中的变形，保持样品原状，达到干燥的目的。,临界液的选择,一般将临界干燥中起临界干燥作用的液体称为媒介液（又称过渡液），它的选择条件是临界温度及压力较低、价格便宜而已保存方便。液态CO2的临界温度为31.4 ，临界压力为72kg/cm2，与其它媒介液相比更符合选择条件。因此，在临界点干燥时，液态CO2已被普遍使用。,临界点干燥的操作程序,1）样品预处理 2）放置样品 3）注入液体CO2 4） CO2 置换 5）临界处理 6）放气取样,生物样品的导电处理,生物样品尤其是经干燥处理的样品,其表面电阻率很高,导电性能很差,当接受电子束照射时,易造成充电和放电效应,以至图像模糊不清。此外生物样品元素成分原子序数低,二次电子发射率低,也难得到反差适当的图像,为增加导电性能,提高二次电子发射率,必须对样品进行导电处理。,
