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1、第十章 基因工程,第一节 基因工程的概念第二节 工具酶及目的基因第三节 载体构建第四节 遗传转化方法第五节 转基因个体的鉴定筛选第六节 基因工程的展望小 结,本章重点及难点:基因工程工具酶表达载体构建遗传转化方法,第一节 基因工程的概念一、遗传工程的概念细胞工程:体细胞融合、体细胞诱变染色体工程:不同物种间转移转移个别染色体、染色体片段甚至完整染色体组细胞器工程:不同物种间转移细胞器基因工程(DNA重组技术):不同物种间转移个别基因。专指基因工程:按照预先涉计好的蓝图,借助实验室技术,将一种生物的某个基因转移到另 一生物中,并使后者定向获得新的遗传性状。,广义遗传工程,狭义遗传工程,二、基因工
2、程的一般步骤,1获得目的基因 2基因与载体结合形成重组DNA分子 3遗传转化目的基因引入受体 4转化体的筛选转基因个体的获得,第二节 工具酶及目的基因基因工程中常用的工具酶主要有:,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类用于生物细胞的破壁,转化,核酸纯化,检测等,一、限制性内切酶是细菌细胞体内的一种水解DNA的磷酸二 酯酶,是基因工程中最重要的工具酶。外源DNA入侵后被这种酶识别并降解,抵
3、御外源遗传信息侵入。称为限制。修饰本身或外源DNA得以继续保留。主要有两大类:I类:以大肠杆菌B菌株产生的EcoB和大肠杆菌K 菌株产生的EcoK为代表。切割DNA时需要ATP、 Mg、S腺苷甲硫氨酸,可切割DNA的任何部 位,产生平齐末端。,II类:以大肠杆菌质粒产生的EcoRI和嗜血杆 菌产生的Hind为代表。切割DNA时只需要Mg 。这是最重要的基因工程酶。II类酶特点: 1.专一性 只作用于特定的核苷酸序列,回文序 列。 EcoRI切点:3CTTAAG55GAATTC3,Hind切点:3AAGCTT55TTCGAA32.产生粘性末端 EcoRI粘性末端3C TTAAG55GAATT C
4、3 HindIII粘性末端3A AGCTT55TTCGA A3,二、目的基因的获得1. 人工合成 蛋白质mRNADNA。最早是考兰纳1970年合成的编码酵母苯丙氨 酸DNA,由77个核苷酸对组成。2.自然分离 这是目前最成功、最常用的方法 鸟枪射击法(散弹枪法)。(1)基因文库的构建将生物体的全基因组用多种内切酶酶解成大小不 等的片段,分别与载体结合形成重组DNA分子,导入 细菌细胞,经无性繁殖(克隆)形成菌落群,该菌落 群包含了生物的全部基因,称为基因文库。,2. 钓取目的基因 利用限制性内切图谱、核酸分子杂交、核酸序 列分析、PCR扩增等方法鉴定分离基因 进 一步进行基因功能验证和表达研究
5、 获得目 的基因。,PCR仪,第三节 载体构建载体:将目的基因导入受体细胞的运载工具。 目的基因载体 重组DNA分子 受体细胞载体需具备的条件: (1) 在寄主细胞内能自我复制,稳定保存。 (2) 有标记性状,便于鉴定选择。 (3) 有多种内切酶的切点,每种酶的切点只有一个,切割后不损害复制和标记功能,并能嵌入外源DNA片断。,1细菌质粒 环状双链DNA分子,现在已商品化。 如pUC质粒系列载体。具有互补显色表现 型。即指来自质粒DNA的 lacZ酶(半乳糖 苷酶)N端的一段氨 基酸残基(-肽) 与-肽缺失的lacZ 酶混合后能恢复 lacZ酶的活性。,PUC18酶切示意图,如将pUC18质粒
6、转入带有lacZ基因a - 肽缺失的受体细菌细胞后,在含有5-溴-4-氯-3-引哚-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoly-galactopyranoside, X-gal)及异丙基D硫代半乳糖苷(IPTG)的培养基上,质粒产生N端的146个氨基酸,受体细菌细胞产生C端的氨基酸,经a - 互补可产生有功能的lacZ酶,水解X-gal产生一种蓝色物质,附着于细菌细胞上使菌落呈蓝色。,当在质粒中插入一个外源DNA片段时, 破坏了a - 肽的阅读框架, 或导致转录或 翻译终止信号改变,使a - 肽不能正确表 达,仅受体细菌细胞产生的C端氨基酸没 有lacZ酶活性,结果在上述同样
7、培养条件 下,形成的菌落为白色。所以白色菌落即 是带有外源DNA片段的阳性克隆。,2.Ti质粒 根瘤(土壤)农杆菌的质粒,是植物基因工程最重要的载体。 根瘤(土壤)农杆菌通过植物擦伤部位 进 入植物体内 Ti质粒(TDNA)脱离根瘤( 土壤)农杆菌 植物细胞 整合到植物 染色体上 植物产生瘤细胞 合成冠瘿碱。 瘤细胞不能再生成植株,必需对Ti质粒加以改 造。 去掉结瘤基因,插入目的基因。,Ti质粒由5大功能区组成: (1)TDNA 直接整合到植物染色体中的DNA序列(LBRB) (2)质粒转移区(PT) (3)冠瘿碱合成基因(opine) (4)复制原点(ori) (5)毒性区(vir)TDN
8、A转移必需,LB,RB,(PT),农杆菌浸染植物示意图,(引自李惟基等,2007),3. 启动子的选择基因功能表达必需具有启动子,启动子决定 转录时间(发育时期)、空间(器官组织)和 数量。某些载体含有启动子。如Ti质粒冠瘿碱合成 基因的启动子能够启动外源基因表达。或者启 动子与目的基因一起结合到载体上。植物基因工程中的目的基因常来自外源物种 ,亲缘关系很远,甚至来自原核生物,必需选 择适当的启动子并加以改造,以使目的基因在 受体植株中得以表达。,例如Bt毒素蛋白基因来自苏云金杆菌,其 本身的启动子不为植物所承认,因而进入植物 细胞后并不诱导Bt毒素蛋白基因表达。以后发 现源于花椰菜花叶病毒C
9、aMV的启动子35S能在植 物中表达,将Bt基因和35S启动子一同导入植物 可合成Bt毒素蛋白。 组成型启动子:在所有组织器官和发育阶段都可表达。如 CaMV35S使受体植株在整个发育时期和各组织都 合成Bt毒素蛋白。,特异型启动子:在特定的发育阶段或器官表达。如来自拟南芥菜的细胞激动素(CTK)基因 启动子(PSAG12)仅在叶组织、且叶片开始衰老 是才表达,促进IPT基因转录。又如烟草花粉特异性表达启动子Ta29或A9 与RNA酶基因barnase连接,导入玉米、水稻等 植物可诱导受体植株产生雄性不育。,第四节 遗传转化将目的基因引入受体细胞。1.载体介导法 目的基因与载体构建成的重组DN
10、A分子引入受体细胞 。如农杆菌介导法 “叶盘共培养法”(leaf disc cocultivtion)。 首先用打孔器从消毒的叶片上取得叶圆片,亦称之叶 盘,将它放在对数生长期的农杆菌的菌液中浸泡数秒 钟后,置于培养基上共同培养23天,待叶盘周围的 菌株生长至肉眼可见菌落时,转移到含有抑菌剂的培 养基中除去农杆菌,同时在该培养基中加入抗生素进 行转化体选择,经过34周培养即可获得转化的再生 植株。,农杆菌叶盘共培养法转化过程(引自李惟基等,2007),2. 基因枪法用金属微粉包裹重组DNA形成金属颗粒,利 用机械装置将其导入受体细胞,实现转化。 目前通用的有三类基因枪: (1)以火药爆炸力作为
11、动力的加速微弹 (2)以电弧放电蒸发液滴作为动力 (3)以高压气体作为动力 基因枪转化不受宿主范围的限制,快速简便, 转化率高,特别是对尚难以利用农杆菌介导转 化的单子叶植物是很有效的方法。,基因枪工作原理(引自李惟基等,2007),基因枪,3.植物花粉管通道法利用花粉管通道,将外源基因在授粉的适当 时期导入胚囊,进入尚不具备正常细胞壁合子 或早期胚胎细胞。DNA可以是总DNA、DNA片段或 重组DNA分子 ,可以是游离的或连接在质粒上 的。由于直接进入早期胚胎细胞,直接产生种 子,不需要利用组织培养获得转化植株;而且 操作简便,经济有效。,方法:植物授粉3060min, 待花粉管生长进入柱头
12、 后,用刀片切掉柱头顶 部,将含有目的基因的 DNA溶液用微量注射器 滴注在柱头的切面,进 入花粉管,随其伸长而 进入胚囊。,DNA溶液,花粉管通道转化法(引自李惟基等,2007),4.微量注射法动物转基因直接用微量注射器将重组DNA分子注入受 精卵,从而获得转基因动物。,第五节 转基因个体的鉴定筛选1.利用选择标记基因 将抗菌素基因(如抗卡那霉素基因、抗青霉素 基因、抗潮霉素基因)连同目的基因导入受体,选择 对青霉素等有抗性的后代植株。 2.利用报告基因目前最常用的报告基因是gus基因。来自细菌,编 码的-葡糖苷酸酶,与5-溴-4-氯-3-吲哚-D葡糖 苷酸酯(简称为X-Gluc)的底物发生
13、作用时,能产生 蓝色沉淀反应,既可用分光光度计测定,又可直接观 察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点。,3.PCR检测 根据报告基因或启动子的序列设计引物,采用 PCR技术可快速鉴定转基因个体。4.核酸分子杂交采用Southern、 Northern、 Western印吸技术鉴 定转基因个体。5.目的基因代谢产物或性状表达这是转基因个体最直接的证据。,第六节 基因工程展望一、植物改造二、动物改造三、微生物改造四、基因治疗,小 结基因工程是目前生物学最活跃的领域,可定向改变生物性状,人为搭配生物基因组合生物性状,甚至创造出全新的生物。基因工程的基本内容包括目的基因获得;基因与载体接合形成重组DNA分子;重组DNA分子导入受体细胞;鉴定筛选获取转基因个体。,