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1、第十章 基因工程,第一节 基因工程的概念第二节 工具酶及目的基因第三节 载体构建第四节 遗传转化方法第五节 转基因个体的鉴定筛选第六节 基因工程的展望小 结,本章重点及难点：基因工程工具酶表达载体构建遗传转化方法,第一节 基因工程的概念一、遗传工程的概念细胞工程：体细胞融合、体细胞诱变染色体工程：不同物种间转移转移个别染色体、染色体片段甚至完整染色体组细胞器工程：不同物种间转移细胞器基因工程(DNA重组技术）：不同物种间转移个别基因。专指基因工程：按照预先涉计好的蓝图，借助实验室技术，将一种生物的某个基因转移到另 一生物中，并使后者定向获得新的遗传性状。,广义遗传工程,狭义遗传工程,二、基因工
2、程的一般步骤,1获得目的基因 2基因与载体结合形成重组DNA分子 3遗传转化目的基因引入受体 4转化体的筛选转基因个体的获得,第二节 工具酶及目的基因基因工程中常用的工具酶主要有：,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等,一、限制性内切酶是细菌细胞体内的一种水解DNA的磷酸二 酯酶，是基因工程中最重要的工具酶。外源DNA入侵后被这种酶识别并降解，抵
3、御外源遗传信息侵入。称为限制。修饰本身或外源DNA得以继续保留。主要有两大类：I类：以大肠杆菌B菌株产生的EcoB和大肠杆菌K 菌株产生的EcoK为代表。切割DNA时需要ATP、 Mg、S腺苷甲硫氨酸，可切割DNA的任何部 位，产生平齐末端。,II类：以大肠杆菌质粒产生的EcoRI和嗜血杆 菌产生的Hind为代表。切割DNA时只需要Mg 。这是最重要的基因工程酶。II类酶特点： 1.专一性 只作用于特定的核苷酸序列，回文序 列。 EcoRI切点：3CTTAAG55GAATTC3,Hind切点：3AAGCTT55TTCGAA32.产生粘性末端 EcoRI粘性末端3C TTAAG55GAATT C
4、3 HindIII粘性末端3A AGCTT55TTCGA A3,二、目的基因的获得1. 人工合成 蛋白质mRNADNA。最早是考兰纳1970年合成的编码酵母苯丙氨 酸DNA，由77个核苷酸对组成。2.自然分离 这是目前最成功、最常用的方法 鸟枪射击法(散弹枪法）。（1）基因文库的构建将生物体的全基因组用多种内切酶酶解成大小不 等的片段，分别与载体结合形成重组DNA分子，导入 细菌细胞，经无性繁殖（克隆）形成菌落群，该菌落 群包含了生物的全部基因，称为基因文库。,2. 钓取目的基因 利用限制性内切图谱、核酸分子杂交、核酸序 列分析、PCR扩增等方法鉴定分离基因 进 一步进行基因功能验证和表达研究
5、 获得目 的基因。,PCR仪,第三节 载体构建载体：将目的基因导入受体细胞的运载工具。 目的基因载体 重组DNA分子 受体细胞载体需具备的条件： （1） 在寄主细胞内能自我复制，稳定保存。 （2） 有标记性状，便于鉴定选择。 （3） 有多种内切酶的切点，每种酶的切点只有一个，切割后不损害复制和标记功能，并能嵌入外源DNA片断。,1细菌质粒 环状双链DNA分子，现在已商品化。 如pUC质粒系列载体。具有互补显色表现 型。即指来自质粒DNA的 lacZ酶（半乳糖 苷酶）N端的一段氨 基酸残基（-肽） 与-肽缺失的lacZ 酶混合后能恢复 lacZ酶的活性。,PUC18酶切示意图,如将pUC18质粒
6、转入带有lacZ基因a - 肽缺失的受体细菌细胞后，在含有5-溴-4-氯-3-引哚-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoly-galactopyranoside, X-gal)及异丙基D硫代半乳糖苷（IPTG）的培养基上，质粒产生N端的146个氨基酸，受体细菌细胞产生C端的氨基酸，经a - 互补可产生有功能的lacZ酶，水解X-gal产生一种蓝色物质，附着于细菌细胞上使菌落呈蓝色。,当在质粒中插入一个外源DNA片段时， 破坏了a - 肽的阅读框架, 或导致转录或 翻译终止信号改变，使a - 肽不能正确表 达，仅受体细菌细胞产生的C端氨基酸没 有lacZ酶活性，结果在上述同样
7、培养条件 下，形成的菌落为白色。所以白色菌落即 是带有外源DNA片段的阳性克隆。,2.Ti质粒 根瘤（土壤）农杆菌的质粒，是植物基因工程最重要的载体。 根瘤（土壤）农杆菌通过植物擦伤部位 进 入植物体内 Ti质粒（TDNA）脱离根瘤（ 土壤）农杆菌 植物细胞 整合到植物 染色体上 植物产生瘤细胞 合成冠瘿碱。 瘤细胞不能再生成植株，必需对Ti质粒加以改 造。 去掉结瘤基因，插入目的基因。,Ti质粒由5大功能区组成： （1）TDNA 直接整合到植物染色体中的DNA序列（LBRB） （2）质粒转移区（PT） （3）冠瘿碱合成基因（opine） （4）复制原点（ori） （5）毒性区（vir）TDN
8、A转移必需,LB,RB,（PT）,农杆菌浸染植物示意图,（引自李惟基等，2007）,3. 启动子的选择基因功能表达必需具有启动子，启动子决定 转录时间（发育时期）、空间（器官组织）和 数量。某些载体含有启动子。如Ti质粒冠瘿碱合成 基因的启动子能够启动外源基因表达。或者启 动子与目的基因一起结合到载体上。植物基因工程中的目的基因常来自外源物种 ，亲缘关系很远，甚至来自原核生物，必需选 择适当的启动子并加以改造，以使目的基因在 受体植株中得以表达。,例如Bt毒素蛋白基因来自苏云金杆菌，其 本身的启动子不为植物所承认，因而进入植物 细胞后并不诱导Bt毒素蛋白基因表达。以后发 现源于花椰菜花叶病毒C
9、aMV的启动子35S能在植 物中表达，将Bt基因和35S启动子一同导入植物 可合成Bt毒素蛋白。 组成型启动子：在所有组织器官和发育阶段都可表达。如 CaMV35S使受体植株在整个发育时期和各组织都 合成Bt毒素蛋白。,特异型启动子：在特定的发育阶段或器官表达。如来自拟南芥菜的细胞激动素（CTK）基因 启动子（PSAG12）仅在叶组织、且叶片开始衰老 是才表达，促进IPT基因转录。又如烟草花粉特异性表达启动子Ta29或A9 与RNA酶基因barnase连接，导入玉米、水稻等 植物可诱导受体植株产生雄性不育。,第四节 遗传转化将目的基因引入受体细胞。1.载体介导法 目的基因与载体构建成的重组DN
10、A分子引入受体细胞 。如农杆菌介导法 “叶盘共培养法”（leaf disc cocultivtion）。 首先用打孔器从消毒的叶片上取得叶圆片，亦称之叶 盘，将它放在对数生长期的农杆菌的菌液中浸泡数秒 钟后，置于培养基上共同培养23天，待叶盘周围的 菌株生长至肉眼可见菌落时，转移到含有抑菌剂的培 养基中除去农杆菌，同时在该培养基中加入抗生素进 行转化体选择，经过34周培养即可获得转化的再生 植株。,农杆菌叶盘共培养法转化过程（引自李惟基等，2007）,2. 基因枪法用金属微粉包裹重组DNA形成金属颗粒，利 用机械装置将其导入受体细胞，实现转化。 目前通用的有三类基因枪： （1）以火药爆炸力作为
11、动力的加速微弹 （2）以电弧放电蒸发液滴作为动力 （3）以高压气体作为动力 基因枪转化不受宿主范围的限制，快速简便， 转化率高，特别是对尚难以利用农杆菌介导转 化的单子叶植物是很有效的方法。,基因枪工作原理（引自李惟基等，2007）,基因枪,3.植物花粉管通道法利用花粉管通道，将外源基因在授粉的适当 时期导入胚囊，进入尚不具备正常细胞壁合子 或早期胚胎细胞。DNA可以是总DNA、DNA片段或 重组DNA分子 ，可以是游离的或连接在质粒上 的。由于直接进入早期胚胎细胞，直接产生种 子，不需要利用组织培养获得转化植株；而且 操作简便，经济有效。,方法：植物授粉3060min， 待花粉管生长进入柱头
12、 后，用刀片切掉柱头顶 部，将含有目的基因的 DNA溶液用微量注射器 滴注在柱头的切面，进 入花粉管，随其伸长而 进入胚囊。,DNA溶液,花粉管通道转化法（引自李惟基等，2007）,4.微量注射法动物转基因直接用微量注射器将重组DNA分子注入受 精卵，从而获得转基因动物。,第五节 转基因个体的鉴定筛选1.利用选择标记基因 将抗菌素基因（如抗卡那霉素基因、抗青霉素 基因、抗潮霉素基因）连同目的基因导入受体，选择 对青霉素等有抗性的后代植株。 2.利用报告基因目前最常用的报告基因是gus基因。来自细菌，编 码的-葡糖苷酸酶，与5-溴-4-氯-3-吲哚-D葡糖 苷酸酯（简称为X-Gluc）的底物发生
13、作用时，能产生 蓝色沉淀反应，既可用分光光度计测定，又可直接观 察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点。,3.PCR检测 根据报告基因或启动子的序列设计引物，采用 PCR技术可快速鉴定转基因个体。4.核酸分子杂交采用Southern、 Northern、 Western印吸技术鉴 定转基因个体。5.目的基因代谢产物或性状表达这是转基因个体最直接的证据。,第六节 基因工程展望一、植物改造二、动物改造三、微生物改造四、基因治疗,小 结基因工程是目前生物学最活跃的领域，可定向改变生物性状，人为搭配生物基因组合生物性状，甚至创造出全新的生物。基因工程的基本内容包括目的基因获得；基因与载体接合形成重组DNA分子；重组DNA分子导入受体细胞；鉴定筛选获取转基因个体。,
