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1、病原学检查技术,1,一、细菌性传染病病原检查,1、显微镜检查法 2、培养检查法 3、生化试验 4、动物试验皮下接种、腹腔接种、肌肉接种、静脉注射,2,二、病毒性传染病病原检查,1、病毒分离培养 （1）样品处理将检疫材料制成混悬液，加入抗生素，离心取上清液 （2）鸡胚接种 （3）动物组织培养,3,鸡胚接种技术,鸡胚的结构,4,气 室,鸡 胚,卵黄囊,尿囊腔,羊膜腔,绒毛尿囊膜,卵 白,卵膜,5,鸡胚的管理 （一）鸡胚的选择 首选健康受精卵，其壳洁白易于观察胚胎，其他受精卵也可使用。接种病毒的受精鸡卵应未感染已知病毒或其它微生物（如新城疫病毒或支原体等），最好来自无特定病原体（specified-
2、pathogens free，SPF）鸡群，接种立克次体的受精鸡卵应来自未食用高浓度抗生素的鸡群。,鸡胚接种技术,6,鸡胚的孵育 受精鸡卵孵育时不要擦洗，以免受细菌污染。最好用能自动调节温度、湿度、气流及翻卵的孵卵箱孵育。如没有，也可用普通恒温箱，但要在温箱中放一盛满水的方盘，以保持适当的湿度。孵育应在3739、40%70%的相对湿度下进行。湿度太高会使气室发育过度，而湿度过低又会导致气室发育不良，甚至造成鸡胚死亡。通气也很重要，如果空气不流通，也可造成鸡胚死亡。为了避免胚胎膜粘连和胚胎发育不均匀，应每隔一段时间转动一次受精鸡卵。,鸡胚接种技术,7,检卵在发育的早期，鸡胚不易辨认，要到45天后
3、才容易看见。因此，检卵要在孵育45天后进行。活的鸡胚绒毛尿囊膜界线较明显，上面的血管清晰可见、成网状，可看到明显的胚胎自主运动。如果胚胎活动呆滞或不能自主运动，血管模糊、变细、折断脱落，绒毛尿囊膜界线模糊，说明鸡胚已濒临死亡或已经死亡。,鸡胚接种技术,8,接种前后都要检卵。接种前检卵是要了解鸡胚的存活情况，标记气室边界和胚胎位置；接种后检卵是为了观察接种后胚胎的状况。,鸡胚接种技术,9,（一）材料准备 1、受精鸡卵 2、孵卵箱或恒温箱 3、捡卵灯，照卵灯 4、砂轮、三棱针 5、卵盘、卵杯 6、其它：1ml注射器，针头，2.5%碘酒，75%酒精，镊子，无菌生理盐水，毛细吸管，橡胶吸头，液体石蜡，
4、蜡和胶布等。,鸡胚接种技术,10,11,（二）接种途径1.尿囊腔接种：该途径一般用于流感、新城鸡瘟病毒和腮腺炎的适应和传代。 2.羊膜腔接种：这途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽漱液）分离病毒。 3.卵黄囊接种：该接种途径主要用于抗流感病毒药物实验。 4.绒毛尿囊膜壳块培养法：该法可用于流感病毒滴定、中和试验和药物实验。,12,1.尿囊腔接种尿囊腔接种常用于流感病毒、新城疫病毒和腮腺炎病毒的适应和传代。进入尿囊腔的这些病毒，能够在尿囊的内胚层细胞中大量繁殖，随后释放到尿囊液中。由于这一接种途径可获得大量的病毒，也常被用于大量制备抗原、疫苗等。,13,接种方法： 选911日龄鸡胚照检，标出
5、气室边界和胚胎位置。 在胚胎面气室上方靠近边界2-3mm处，避开血管作一标记，用碘酒消毒标记处卵壳，在标记处钻一孔 再次用碘酒消毒钻孔区，将注射器针头经孔刺入尿囊腔，注入0.10.2ml接种物 将蜡熔化封孔，3335孵育4872小时。每日照检，24小时内死亡的应弃去。,1.尿囊腔接种,14,收获：收获前先将鸡卵置4冷冻618小时，如急于收获也可将鸡胚置-20、1小时左右。冷冻后的鸡卵钝端向上置于卵杯上，将气室上方卵壳用碘酒或70%的酒精消毒后去除，暴露壳膜，用无菌镊子小心地将壳膜从绒毛尿囊膜上撕下，不要损伤绒毛尿囊膜。用注射器或吸管经绒毛尿囊膜刺入尿囊腔，吸出尿囊液，置低温保存。同时做无菌培养
6、。,1.尿囊腔接种,15,16,2.羊膜腔接种羊膜腔接种主要用于从临床或现场材料（如患者咽漱液等）中分离病毒。接种到羊膜腔中的接种物能够被胚胎吞咽和进入呼吸管，可遍及各种组织和细胞，使具有特定细胞亲嗜性的病毒被充分利用，从而提高病毒繁殖的可能性。由于可收获的羊膜组织或羊水较少，为了使病毒适应在尿囊内胚层生长，从而获得大量的病毒，可将经羊膜腔接种分离到的病毒再经尿囊腔传代。,17,接种方法：选1012日龄鸡胚检卵后，标出气室边界和胚胎位置。用碘酒消毒鸡卵钝端（气室上方）的蛋壳，在气室上方靠近胚胎侧的卵壳上钻一孔，钻孔区再次用碘酒消毒。用无菌眼科小剪子沿钻孔周围剪去少许，开一小窗，勿损伤内层壳膜，
7、经小窗向气室内滴入一滴无菌液体石蜡。将卵置照卵灯上，可清楚地看到胚胎的位置。将注射器瞄准胚胎的腭下胸前，刺入后注入0.10.2ml接种物。用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将窗口封上。接种后的受精卵根据接种的病毒在33、35或37的条件下孵育4872小时。,2.羊膜腔接种,18,收获：收获前先将鸡卵置4冷冻618小时，时间不能过长，过长会引起散黄。冷冻后的鸡卵钝端向上置于卵杯上，将气室上方卵壳用碘酒或75%的酒精消毒后去除，暴露壳膜，用无菌镊子小心地去除壳膜，使其与绒毛尿囊膜分开，不要损伤绒毛尿囊膜。用注射器或吸管经绒毛尿囊膜刺入尿囊腔，吸出尿囊液。然后，一只手持镊子将羊膜轻轻提起，另一只手持注射器
8、或吸管刺入羊膜腔吸取羊水，置低温保存。同时做无菌培养。,2.羊膜腔接种,19,20,3.绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种常常用于分离和繁殖在绒毛尿囊膜上产生斑和痘的病毒，如牛痘、天花、单纯疱疹和鸟痘病毒。可在绒毛尿囊膜上滴定这些病毒，因为感染性病毒颗粒的量可以通过产生的斑和痘的数目来计算。还可用于抗体滴定试验，因为斑和痘的个数减少的程度与抗体浓度有关。,21,定位： 将胎盘部分及自然气室部分用铅笔画出，在胎盘与蛋白交界处（无血管区）画一直径约1cm的等边三角形。,卵窗,3.绒毛尿囊膜接种,22,气 室,鸡 胚,卵黄囊,尿囊腔,羊膜腔,绒毛尿囊膜,卵 白,卵膜,23,取卵壳： 消毒后取下所画三角形区
9、域的卵壳，注意卵膜不要碰破，于卵膜中央刺一小口（不要伤及绒毛尿囊膜）， 造人工气室： 在自然气室部分用大注射器针头钻一孔，用橡皮头自气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下陷形成一“人工气室”,3.绒毛尿囊膜接种,24,接种：去除卵膜，于绒毛尿囊膜上滴上病毒0.10.2ml。 封口：用胶布封口，胶布事先用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。 培养：放入温箱培育4天，然后收获病毒。,3.绒毛尿囊膜接种,25,收获：收获前检卵，看人工气室是否仍然存在，如果不存在，轻轻地吸气室上的孔。用碘酒消毒人工气室上的卵壳，去掉壳和壳膜至人工气室的边缘，尽量最大范围地暴露绒毛尿囊膜，用无菌剪子沿人工气室的边缘将接种
10、病毒的绒毛尿囊膜剪下，低温保存。同时做无菌培养。,3.绒毛尿囊膜接种,26,4.卵黄囊接种卵黄囊接种常用于分离和繁殖立克次体，也可用于分离和传代衣原体。这些大的病原微生物易于在沿卵黄排列的内胚层细胞中生长。,27,接种方法：选用56日龄鸡胚，因为卵黄囊在这个阶段比较大，易于接种，并为病毒的繁殖提供了一个比较大的表面。检卵后，用碘酒消毒气室端卵壳，在气室中心的卵壳上钻一孔，再次用碘酒消毒钻孔处，将注射器的针头经钻孔沿卵的纵轴刺入3cm左右，进入卵黄囊中，通常注入0.51ml接种物。用蜡熔化封口，3537孵育38天，视接种的病毒或立克次体而定。,4.卵黄囊接种,28,4.卵黄囊接种,29,收获：先
11、将鸡胚冷冻，去除气室上方卵壳，用无菌镊子揭去壳膜，撕开绒毛尿囊膜后，将鸡胚内容物倒入无菌培养皿中，注意要避免内容物沿卵壳流下而发生污染。将鸡胚从卵黄囊上剪下，如收获鸡胚，则去双眼、爪和嘴，置无菌瓶中低温保存。倒出卵黄囊中的卵黄，用生理盐水将卵黄囊洗净，置无菌培养皿或烧瓶中低温保存。并取一块做无菌试验。,4.卵黄囊接种,30,注意事项,鸡胚为一活的有机体，因此要严格无菌操作，同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种后24小时内死亡应不计结果。,31,收获物的检测（一）无菌试验 鸡胚培养所收获的材料应当未受细菌污染。检查收获物是否受到细菌污染，可在收获时取一小块组织或将第一滴液体（如尿囊液）放入盛有
12、23ml无菌肉汤的小试管中，37培养36小时。如肉汤依旧清亮透明，无菌落出现，说明没有污染；如肉汤变混浊，有絮状菌落出现，说明受到细菌污染。被细菌污染的收获物应灭菌后弃掉。,32,病毒检测检测鸡胚培养的收获物中是否有病毒存在，有直接观察法和试验法两种方法。 1、直接观察法 有些病毒在鸡胚中繁殖，可对鸡胚产生眼睛可见的直接损害，可通过直接观察法确认病毒的存在。,33,这些损害有： （1）在绒毛尿囊膜上形成特殊的增生性损害或痘疱，如各种痘类病毒和疱疹病毒，常产生白色或灰色痘疱，并常伴有膜上血管充血，偶可见出血； （2）引起鸡胚死亡，如新城疫病毒、流行性乙型脑炎病毒，但应与接种损伤和细菌污染引起的死
13、亡区别开； （3）造成鸡胚特殊损害和胚胎生长迟缓,34,2、试验法有些病毒在鸡胚中繁殖并不造成可见损害，直接观察无法确认病毒的存在，必须用试验加以证实。有些病毒能引起红细胞凝集，可对羊水或尿囊液进行血凝试验证明病毒的存在，如流感病毒、新城疫病毒和流行性腮腺炎病毒等。还可以用特异性免疫血清与收获的液体或组织做补体结合试验来证明病毒的存在。,35,病毒的细胞培养,36,基本原理,通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增值。在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上，置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变（CPE）
14、待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反复冻融3次，置-70保存备用。,37,细胞病变效应 英文名：cytopathic effect （CPE) 定义：在体外实验中，通过细胞培养和接种杀细胞性病毒，经过一定时间后，可用显微镜观察到细胞变圆，坏死，从瓶壁脱落等现象，称之细胞病变作用。,基本原理,38,主要有以下几种： 1.整个细胞都发生改变，有两种情况，其一是胞核及整个细胞都发生肿胀，胞浆呈颗粒样变化，胞膜边缘不整齐；其二是，整个细胞皱缩，变圆直至碎裂，脱落等，多见于肠道病毒、痘病毒、呼吸病毒、鼻病毒、科萨奇病毒；2.细胞发生聚合，如腺病毒；3.细胞融合形成合胞体，即多数细胞发生相互融合而成“巨
15、细胞”，但各个细胞核仍然能分辨清楚，如副粘病毒、疱疹病毒；4.细胞仅产生轻微病变，如正粘病毒、狂犬病毒、冠状病毒、逆转录病毒以及沙粒病毒。,基本原理,39,细胞培养的基本概念,传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。,40,原代细胞培养,概念：从供体获取组织细胞后在体外进行的首次培养。 优点：生物学特性未发生很大变化，细胞染色体仍为二倍体，接近和反映体内生长特性，适合做药物测试、细胞分化及病毒学方面的实验 缺点：传代次数较多细胞就会衰亡。,41,传代细胞培养,概念：原代细胞经过一系列传代，产
16、生变异，转化为能够连续传代的细胞。 传代细胞可以直接从肿瘤组织获得，又可以通过人工驯化获得。 常用的传代细胞：PK-15、IBRS-2、Vero、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等,42,培养实验用品的前期处理,1.清洗和浸泡:(1)玻璃器皿(2)塑料器皿 2.包装 3.消毒：在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。,43,4.细胞培养用液及培养基（液）:,（1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。 （2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.27.4，不含钙镁离子 ， 可高压除菌。 （3）消化液 :胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为025，pH值7.2左右。需过滤除菌。EDTA液：常用浓度为 002，配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。,44,(4) 培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染,
