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1、HPV分子生物学及宫颈病变病理诊断,一，HPV简介二，HPV与宫颈癌的关系三，HPV相关细胞学形态改变及判读要点四，HPV检测方法及宫颈病变的病理诊断五，HPV疫苗的研究进展,（一）HPV简介,1.完整的病毒颗粒为一个感染单位，外形呈20面体对称型，外壳有72个衣壳体。2.HPV基因组为环状双链DNA，含有近8000个碱基对。分为早期区，晚期区和长控区。,Human papillomavirus（HPV）,早期转录区：参与病毒DNA的复制，转录，翻译，调控和细胞转化。晚期转录区：编码病毒的衣壳蛋白。上游调控区：又称长控区，通过与转录因子的相互作用调节早期区基因的转录，参与病毒复制，转录的调控。
2、,（二）HPV与宫颈癌的关系,宫颈癌是第一个被确定有单一明确病因的癌症，即高危型HPV感染。HPV感染普遍存在，但是引起的宫颈癌却相对少见。高危型HPV总感染率大概在10%，15岁到25岁感染率最高。HPV感染平均为6-9个月，70%的HPV感染在一年内清楚，两年内的清除率可达90%,HPV感染引起的低度病变（CIN1）不是癌前病变，大多会自然转愈，对于任何致癌性HPV，诊断CIN1并不意味着发展成CIN3的风险比活检阴性者高。HPV病毒量的多少跟宫颈癌的发生有一定的相关性，但是不成正比，不能预测疾病的进展。有效预防HPV感染，就能减少甚至不得宫颈癌。,通过微小破损感染上皮组织。通过胞吞作用使
3、整个病毒颗粒侵入上皮基底层细胞，继而通过不明的机制被传送到细胞核。正常情况下，病毒基因中的E1，E2，E4，E5低表达，有利于病毒基因组的维持和细胞增生。表达水平增高促进病毒基因组复制。随着宿主角质细胞开始分裂并逐渐分化为上皮表层，L1和L2蛋白表达促使病毒组装形成感染性病毒颗粒，而E4高表达则使细胞胞浆破坏，凹陷，促进病毒释放。,HPV自然生活史（游离状态）, 高危型HPV病毒持续性感染。 病毒DNA与宿主细胞DNA发生整合，病毒与之整合的部 位位于E2编码区。 HPV整合导致E2片段缺失，失去了对E6，E7的正常调控，导致其过度表达。 E6与P53结合并使之降解，并能阻止和干扰细胞凋亡，引
4、起细胞无限增生并向恶性转化。 E7与pRB结合，使E2F得以释放，从而使细胞周期由G1期向S期转化，细胞周期失控而发生永生化。 E6，E7编码的原癌蛋白表达，导致人类染色体端粒体酶逆转录酶基因（hTERC）扩增，维持端粒长度，细胞永生，免于凋亡，发生癌变。,HPV致癌机制（整合状态）,宫颈癌发生过程：,（三）HPV相关细胞学形态改变及判读要点,多数HPV感染并没有细胞学异常，大约只有30%的HPV感染会产生相应的细胞病理学变化。HPV引起的细胞学形态改变不仅仅表现挖空细胞特征，还包括ASC和HSIL的病变特点。挖空细胞只说明有HPV感染，但无法分清楚是低危型还是高危型。HPV分子生物学行为对应
5、TBS报告术语。,典型的挖空细胞判读为LSIL，不典型的挖空细胞判读为ASC-US或ASC-H.理解LSIL的定义，其实就是要弄清楚以下这个问题：组织学的CIN1指的是下1/3的细胞异型，而与之对应的LSIL则是表层细胞形态的异常，如何解释？,LSIL,LSIL,糖原溶解细胞VS挖空细胞,LSIL（HPV病毒游离状态，一过性感染）细胞学诊断的要点：1.细胞成熟，为表层细胞来源。2.核周空晕透亮，为胞浆塌陷或被破坏造成。,LSIL ASC-US,ASC-US,ASC-US（可疑HPV一过性感染，无典型挖空表现）细胞学诊断要点：1.核有一定异型，有挖空趋势，但核周空晕不透亮。2.成片聚集的表层细胞
6、，核轻度增大或双核，可伴有角化不全现象。,HSIL,HSIL（HPV病毒整合状态，持续性感染）细胞学诊断要点：1.高核浆比。2.核的异型性，主要体现在核膜的不规则以及核染色质增粗。,CIN3,CIN3,CIN3（ HPV病毒整合状态，持续感染，向宫颈癌进展）组织学诊断要点：1.核异型明显（肿瘤异倍体细胞的表现）。2.中表层细胞出现病理性核分裂像。3.全层细胞密度增加，极性紊乱，丧失正常的组织结构。4.表层细胞不出现典型的挖空细胞形态。,（四）HPV检测方法及宫颈病变的病理诊断,HPV检测：1.病毒DNA检测2.病毒mRNA检测3.病毒相关蛋白检测4.病毒靶向检测,低危型HPV主要见于生殖器疣，
7、常见的型别为6型和11型。高危型HPV与癌前病变和宫颈癌相关，常见的型别为16型和18型。检测方法有分型检测与不分型检测。,HPV-DNA检测,HC2（不分型）,操作步骤： 裂解杂交捕获抗原抗体反应信号放大结果判读,HC2结果判读：1.0pg/ml为阳性，相当于5000拷贝。如何正确理解HC2的检测结果？,PCR-RDB（分型检测）,DA8000全自动核酸分子杂交仪,HPV-DNA分型检测的临床意义？ 能区分持续或反复感染。 不同型别有不同的患病风险。 不同型别有不同的处理方案。ASCCP2009版指南指出：30岁女性 细胞学阴性，而HPV16或18型阳性者，建议阴道镜检测。 细胞学阴性，其它
8、HR-HPV型阳性者，一年后复查HPV-DN 和细胞学。,HPV E6，E7 mRNA检测,HPV 的E6、E7是病毒癌基因，它们的翻译产物介导抑癌基因p53和Rb的降解，从而干扰细胞周期调节。如若癌基因没有表达，则细胞本身不会发生癌变。E6蛋白能与细胞内 E6相关蛋白 ( E6 AP)形成复合物 ,特异性地结合 p53,并通过依赖蛋白酶系统将其水解 ,使其对细胞生长负调节功能丧失 ,从而引起细胞无限增生并向恶性转化。E7蛋白是 HPV的主要转化蛋白 ,与控制细胞周期有关的肿瘤抑制蛋白视网膜母细胞瘤蛋白 (Rb)亲和力极高 . E7与 Rb结合使 Rb E2F复合物解离 , E2F被游离 ,从
9、而发挥其转录因子的作用 ,导致细胞周期失控而发生永生化。HPV E6/E7mRNA 在宫颈组织中表达，说明HPV 病毒表达出癌基因活性。,bDNA技术原理,HPV 相关蛋白检测,人体的细胞周期包括G1，S,G2，M四个时相，且存在多个检查点调节各时相点的转换及细胞周期进程。其中以G1S期最为重要，因为细胞一旦从G1期进入S期，则不再依赖外界信息刺激而很快自动完成分裂过程，因此G1卡点可以决定细胞继续增值或进入G0期或离开细胞周期进入终末分化或死亡。细胞周期卡点的转换受控于“细胞周期蛋白（cyclins）-细胞周期依赖性激酶（cdks）-细胞周期依赖性激酶抑制因子（clks）”这组分子网络。研究
10、最为广泛的一组是：Cyclin D1/cdk4/P16。P16在细胞周期G1卡点中与CyclinD1竞争结合cdk4并特异性抑制其活性，组织细胞尤其是带有损伤DNA的细胞进入S期，从而控制细胞分裂。,P16：1.在LSIL的敏感性和特异性为74%，在HSIL中则达到97%以上。2.在LSIL中的表达为点状，散在分布；在HSIL中的表达为灶状，片状连续分布。,P16,P16,Cyclin D1：1.在正常宫颈组织中低表达，在CIN和宫颈鳞癌中表达增加并逐渐加强。2.促进细胞周期紊乱，细胞异常增殖。CyclinD1过度表达可能导致细胞G1期缩短，细胞过度增殖失控而促进肿瘤的发生。,Ki-67:1.
11、在细胞周期的G1后期，S,G2，M期呈高表达，而在静止的G0期细胞呈低表达。2.Ki-67半衰期短，脱离细胞周期后迅速降解，检测结果的可靠性明显优于半衰期长的增殖细胞核抗原，是最能反映细胞增殖状态的蛋白标志物之一。3.Ki-67用于CIN的鉴别诊断，主要用于萎缩性病例，而对反应性改变，化生性改变，修复性改变意义不大（细胞增殖指数也很高）。,Ki-67,HPV分子靶向检测,hTERC:宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增。其中，涉及到的最重要的基因可能是人类染色体末端酶（hTERC）基因。该基因的扩增可阻止细胞凋亡，因而可导致肿瘤产生。现已得知，3号染色体长
12、臂扩增能准确区分宫颈细胞高度癌前病变与低度癌前发育异常，鉴别诊断的敏感性及特异性均在90%以上,人类染色体末端酶基因-hTERC基因,hTERC基因定位在3q26.3hTERC基因的作用： 编码人类染色体端粒酶的重要基因， 影响细胞凋亡。,端粒酶活性,端粒,影响,影响,与细胞凋亡密切相关,hTERC基因状态,hTERC检测的意义,49,ASCUS CIN1,CIN2/3,TERC 基因,ASC CIN1,LSIL与HSIL的辅助判断指标,宫颈脱落细胞FISH探针,CSP3,TERC,hTERC基因定位于3q26.3,3号染色体着丝粒信号,正常,扩增,hTERC基因检测（fish）,（四）HPV
13、疫苗,目前已分离出的HPV达100多型，其中至少14型可导致宫颈癌。16型与18型是最常见的高危型，大约70%宫颈癌由这两种型别引起。6型和11型是最常见的低危型，与90%生殖器尖锐湿疣相关。中国：HPV16（76.7%），HPV18（7.8%），HPV31（3.2%），HPV52（2.2%），HPV58（2.2%）。,HPV流行病学,HPV疫苗：四价疫苗（6,11,16,18）2006年6月，美国FDA正式批准美国默克公司生成的四价预防性疫苗Gardasil的注册。建议针对9-26岁的女性使用。在美国和其它部分国家，该疫苗还被批准用于预防性男性生殖器疣。,二价疫苗（16,18）：2007年注
14、册的英国葛兰素史克生成的二价疫苗Cervarix.批准用于10岁以上的女性。尚未申请在男性中使用的适应症。,疫苗为无菌混悬液，需储存在2-8环境下，不能冷冻。肌肉注射，注射后观察15分钟。接种分三次进行（第一针,1或2个月后第二针，6个月后第三针）对其它疫苗有严重过敏史的人或孕期女性禁用。预防性HPV疫苗无法治疗已存在的病毒感染或相关病变。治疗性疫苗需要进一步研制。,总结,HPV病毒与宫颈病变关系密切，不同程度的宫颈病变其实就是HPV病毒感染机体后不同分子生物学行为的表现，而病变的多样化与病毒型别，机体抵抗力及个体差异相关联。宫颈癌筛查最重要的目的是发现并且治疗那些经过初筛发现异常，并最终活检确诊为高级别或以上的病例。宫颈病变LISL与HSIL的明确诊断，越来越有赖于多种检测项目的联合应用及准确分析。,谢谢大家的时间与关注！,
