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1、实验目的：,掌握：1.层析技术的基本概念2.凝胶层析法分离不同物质的原理3.凝胶层析法基本操作了解：1.层析法的分类2.常用的层析技术。,教 学 内 容,一、层析技术 1. 层析技术的基本概念；2.层析法的分类；3.常用的层析技术 二、凝胶层析法分离核黄素和丙种球蛋白 1.原理；2.基本操作及注意事项,一、层析技术,利用混合物中各组分的物理化学性质的差异，使各组分在层析的两相中不同程度的分配，从而将各组分分离的方法。,（一）基本概念,固定相,流动相,（二）分类,根据固定相基质的形式分类纸层析、 薄层层析、柱层析根据流动相的形式分类液相层析、气相层析 根据分离的原理不同分类吸附层析、分配层析 、
2、凝胶过滤层析离子交换层析、亲和层析,（三）常用层析技术,吸附层析。 吸附能力 分配层析。分配系数 凝胶过滤层析。 分子大小，分子形状 离子交换层析。 离子亲和力 亲和层析 。 分子亲和力,二、凝胶层析法分离核黄素 和丙种球蛋白,1.实验原理凝胶层析：凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。,Ve = VO + Kd Vi,当Kd=1时，Ve=VO+Vi为全渗入。 当Kd=0时，Ve=VO为全排阻。 当0Kd1时，Ve=VO+KdVi为部分排阻。,2.操作及注意事项,学生传递，4-6组同时加入。搅匀凝胶，长吸管吸下层胶，沿壁转圈加入
3、，防止气泡，动作要快，（或搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内）防止分层，加至距玻璃管上口2cm处。注意滴管中不要残留胶。,小组分工：1人加水，1人收集并控制流速,检查膜,始终保持流洗速度,切勿搅动胶面，且谨防错加双缩脲,1、 装 柱,2、 测 外 水 体 积,柱高约10cm，无气泡无断层无干裂，表面平整,相切，关塞，上面加蒸馏水流洗，下面同时收集流洗液,凝胶上始终保证2cm高的水，4d/m用小烧杯接即可，查滴数,3、 分 离 样 品,4、 回 收 凝 胶,3、实验结果,1观察装柱情况，高度、有无气泡、断层、裂缝。 2观察蓝色葡聚糖色带下降情况。 3观察样品洗脱情况，计算外水体积，洗脱体积，并比较，
4、分析。 4观察加入双缩脲后的变化，绘出表格及洗脱曲线。,(1)固定相 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质(如吸附剂，凝胶，离子交换剂等)，也可以是液体物质(如固定在硅胶或纤维素上的溶液)，这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。 (2)流动相 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。 (3)分配系数及迁移率(或比移值) 分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量(浓度)的比值，常用K 来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。 K = Cs / Cm 其中Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度。,其他资料,
