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1、通过饮奶进行乳糖不耐受人群的筛查及干预对策的研究,内蒙古伊利实业集团股份有限公司,2008.9,云战友,目录,研究背景 研究目的 研究内容 我国乳糖不耐受人群的调查 高水解率低乳糖牛奶的开发 高水解率低乳糖牛奶对乳糖不耐受的干预试验 该项研究得到的支持和相关评价,研究背景,很多人由于小肠上皮细胞乳糖酶缺乏，饮用牛奶后乳糖不能被分解吸收，乳糖进入结肠后被肠道细菌分解，产生大量乳酸、甲酸等短链脂肪酸和氢气，造成渗透压升高，使肠腔中的水分增多，引起腹胀、肠鸣、肠绞痛直至发生腹泻等症状，这种现象在医学上称为乳糖不耐受症。除表现为乳糖不耐症者外，还存在乳糖代谢不良但不表现为症状的人群，本研究中称之为乳糖
2、吸收不良者。乳糖不耐受症与乳糖吸收不良（不表现为症状但乳糖代谢不良）合称为乳糖酶缺乏。,研究背景,乳糖酶缺乏在欧洲北部后代中占15 % ,黑人及拉丁人群占80 % ,而美国印第安人和亚洲人可高达100 % -Swagerty DL Jr. , Walling AD , Klein RM. Lactose intolerance J . Am Fam Physician , 2002 , 65(9) :1855 - 1856. 6-10岁亚洲儿童的乳糖不耐受85-100% - Quak SH. Lactose intolerance in Asian children. J Paediatr C
3、hild Health 1994;30:912. 杨月欣教授研究了中国儿童乳糖不耐受症的发生率，结果表明3-5岁、7-8岁、11-13岁组儿童中，乳糖不耐受发生率分别为12.2%、32.2%、和29.0%，乳糖酶缺乏发生率分别为38.5%、87.6%、87.8% -卫生研究，Vol.28,No.1,1999。肖玉桦等人的调查结果表明我国健康成人的乳糖酶缺乏率高达92% - 现代预防医学，Vol.26, No.1,1999; 有如此高的比例吗？,研究背景,分别给成人受试者50、25、12.5g 乳糖，乳糖酶缺乏率分别为100%、86.4%、59.1%-新医学，1988，Vol.19：512；分别
4、给成人受试者25、12.5、6.25 g 乳糖，乳糖酶缺乏率分别为85%、48.9%、2%;-中国药学杂志，1998，Vol.33，No.5分别给受试者（7-18岁）25、12.5、6.25 g 乳糖，乳糖酶缺乏率分别为79.3%、19.7%、7.2%;-中国学校卫生，2002，Vol.23，No.2乳糖酶缺乏率、不耐受症状发生率受乳糖摄入量的影响,研究目的,有必要根据年龄，设计每次摄入牛奶的适宜量，通过饮用适宜量的牛奶，筛查得到乳糖酶缺乏数据和乳糖不耐受数据。这一数据对于生活习惯和健康的关系最大； 在此基础上，研究如何满足乳糖酶缺乏和乳糖不耐受消费者饮用牛奶的需要。,研究内容,我国乳糖不耐受
5、人群的调查 高水解率低乳糖牛奶的开发 高水解率低乳糖牛奶对乳糖不耐受的干预试验,我国乳糖不耐受人群的调查,伊利集团联合中科院生物物理所中生金域诊断技术有限公司、哈尔滨医科大学、西安交通大学医学院少儿卫生教研室、中国优生科学协会钙工程专业委员会对北京、哈尔滨、西安三大城市3-70岁的人群通过饮奶，进行乳糖不耐受调查。,我国乳糖不耐受人群的调查,试验方法： 测试前两天至测试结束前，受试者禁止饮奶及奶制品； 测试前一天至测试结束前，受试者禁食大量水果（一天250克以上）； 测试当天早晨，要求受试者不进食、不饮水，空腹到测试现场参加测试。 将1490名志愿者按年龄段分为6组，每组饮用不同数量的纯牛奶（
6、乳糖含量为4.8 % ） 。受试者一次饮完液态纯牛奶，同时吃完现场配送的面包，饮奶后至测试结束前，不得再饮水、进食，饮奶后1小时排空尿液，饮奶后2小时收集尿液，然后用中生金域诊断技术有限公司的尿半乳糖试剂盒测定被调查人群的乳糖耐受情况。,我国乳糖不耐受人群的调查,分组情况和饮奶量 3-4岁 125ml 5-6岁 250ml 7-9岁 300ml 10-12岁 350ml 13-17岁 400ml 18岁 450ml,我国乳糖不耐受人群的调查,乳糖耐受能力的评价标准 测定结果 饮奶后的症状 乳糖耐受能力 阴 性 无消化道症状 乳糖耐受 阳 性 无消化道症状 乳糖吸收不良 阳 性 有腹痛、腹部不适
7、、恶心、腹胀、腹泻一项 乳糖不耐受症阳性（乳糖吸收不良、乳糖不耐受症）统称为乳糖酶缺乏,我国乳糖不耐受人群的调查,不同年龄组牛奶乳糖不耐受的检出情况,我国乳糖不耐受人群的调查,经常饮奶诱导不了乳糖酶活性，症状可弱化,-卫生研究，Vol.28,No.1,1999。,乳糖酶为非诱导酶-Newcomer AD , McGill DB. Gastroenterology ,1967 ,53 (6) :881 - 889.,乳糖酶缺乏受遗传影响 ？,乳糖酶基因位于2 号染色体长臂(2q21) ，酶蛋白先是由小肠上皮细胞合成一个220KD的前体物,然后再继续加工剪切成180KD 的成熟酶蛋白。多数研究认为
8、：断奶后乳糖酶活性的下降不依赖于膳食中乳糖的存在,多项研究均证明乳糖的摄入并不能维持或增强乳糖酶的活性,因此进食乳糖并不能抑制基因决定的乳糖酶的表达 。芬兰儿童对牛奶过敏与其基因型为C/ C - 13910 相关,其成人型乳糖酶活性低下也与该基因型相关 。有研究表明我国北方5个少数民族的乳糖不耐受和该基因在该处的变异关系不大。还有一种乳糖不耐受也可由腹泻导致。但一般可以在腹泻症治愈后恢复。,研究内容,我国乳糖不耐受人群的调查 高水解率低乳糖牛奶的开发 高水解率低乳糖牛奶对乳糖不耐受的干预试验,高水解率低乳糖牛奶的开发,乳糖酶的选择 乳糖水解率快速方法的开发 低乳糖牛奶生产工艺的确定 低乳糖牛奶
9、在货架期内的褐变情况,乳糖酶的选择,目前仅来源于微生物的半乳糖苷酶有工 业应用价值 ，不同微生物来源的半乳糖 苷酶的性质有所不同。 考虑安全性、经济性以及适应性，最终选择 来源于乳酸克鲁维酵母产生的半乳糖苷 酶。,乳糖酶的选择,随着反应温度的升高，乳糖酶催化乳糖的水解率增加。当达到一定温度 时，温度再升高，乳糖酶催化乳糖的水解率就开始降低。 从图中可以得到，该酶的最适反应温度为39-41。,乳糖酶最适反应温度的确定,乳糖酶的选择,pH值低于6.5时，酶活力随着pH值的下降迅速降低，pH值在6.5-7.0时活 性达到最大值。 该酶的最适反应pH值为6.5-7.0，该酶最适pH值恰好在鲜乳的天然p
10、H 值之间，因此适合鲜奶的水解。,乳糖酶最适反应pH值的确定,冰点法,低乳糖牛奶产品的水解率是衡量其乳糖水解程度的一项重要的生产指标。用HPLC法测定乳糖需要昂贵的仪器，不便于工厂使用。为了探寻一种适合于低乳糖牛奶生产中检测分析需要的简便快捷的新方法，开发了冰点法，利用冰点降低幅度可以测定牛奶乳糖水解率。得出较准确的冰点公式为X=(+0.5601)/-0.2907方法特点：节省检测时间，节约检测成本。HLPC每测定一个样子，费用在200元。而冰点仪每开一次机进行校正的费用仅为12元，可以测定几十个样品。,乳糖水解率快速方法的开发,乳糖水解率快速方法的开发,葡萄糖氧化酶分光光度法,牛奶中1分子的
11、乳糖水解成1分子的葡萄糖和1分子的半乳糖，通过测定葡萄糖的量就可以得到已水解的乳糖量。测定原理如下：-D葡萄糖 + O2 + H2O D-葡萄糖酸 +H2O2H2O2 + 4-AAP + 苯酚 红色醌化物 + H2O 1ml 乳糖水解牛奶稀释到10ml ，取20L到葡萄糖酶试剂与苯酚试剂等体积混合液，加好试剂后置37恒温水浴反应20min，在505nm波长处测定吸光度值并计算葡萄糖浓度。,乳糖水解率快速方法的开发,将低乳糖牛奶分两份，一份直接测葡萄糖，另一份加入10000NLU/L 的乳糖酶置于39的环境中反应2小时充分水解牛奶重残余乳糖，然后测定葡萄糖的浓度。乳糖水解率的计算公式乳糖水解率=
12、 100%,葡萄糖氧化酶分光光度法,乳糖水解率快速方法的开发,葡萄糖氧化酶法准确度试验,乳糖水解率快速方法的开发,葡萄糖氧化酶法精密度试验,低乳糖牛奶生产工艺的确定,流程1：原料奶 杀菌 冷却到最适温度 加酶搅拌 水解 UHT 冷却 包装,低乳糖牛奶生产工艺的确定,随着反应时间的延长，添加不同浓度乳糖酶的牛奶的水解率在增加，当水解率超过80%以上，乳糖的水解率趋于平缓。 乳糖水解率达到70%就可以解决乳糖不耐受的症状，综合考虑，在最适反应温度下水解牛奶中乳糖的最佳工艺条件是酶的添加量为1500NLU/L，水解时间2小时。,最适温度（39）下乳糖水解率随时间的变化,低乳糖牛奶生产工艺的确定,流程
13、2：原料奶 巴氏杀菌（85，15S） 冷却到（4） 加酶搅拌 水解 UHT 冷却 包装,低乳糖牛奶生产工艺的确定,经过12小时，添加2000NLU/L乳糖酶的巴氏杀菌牛奶的水解率达到70%以上。 在低温下水解牛奶中的乳糖的最佳工艺条件为添加2000NLU/L的乳糖酶放置一 个班次的时间。,低温下乳糖水解率随时间的变化,低乳糖牛奶生产工艺的确定,流程3：原料乳 杀菌(UHT) 冷却到15 灌装 包装 水解无菌添加乳糖酶,无菌乳糖酶的制备,采用膜过滤技术进行原料除菌，使产品在无菌添加时不会受到二次污染。采用膜过滤可以使酶活力损失降低至最小，最大限度地保持酶制剂活力，同时能保证乳糖酶的颜色呈现透明色
14、。首先将乳糖酶通过无菌膜除去杂质和微生物，加工成无菌包装的乳糖酶，然后通过无菌在线添加设备将无菌袋包装的乳糖酶直接添加到无菌罐或者无菌灌装机中。,低乳糖牛奶生产工艺的确定,在线无菌添加的实现无菌添加工艺采用高温高压蒸汽作为产品的保护屏障，在无菌酶制剂添加到产品的过程中始终保持一个双向无菌的环境状态，从而保证产品、酶制剂的无菌性，防止产品免受二次污染。在整个无菌酶制剂的添加过程中，产品和酶制剂的温度保持在2025的温度下。,低乳糖牛奶生产工艺的确定,低乳糖牛奶生产工艺的确定,添加250,500,750NLU/L的乳糖酶，经一周后乳糖水解率均达到90%以上。 一般UHT奶经一周检验合格后才投放市场
15、，当产品到达消费者手中时，乳糖可 以完全水解，无菌添加的最佳工艺为添加250NLU/L，贮存一周。,无菌添加乳糖水解率随时间的变化,低乳糖牛奶生产工艺的确定,三种工艺的比较 分别对三种工艺流程进行试验，发现使用流程1时，乳糖水解率达到70%时所需的时间短，但牛奶容易遭受微生物的污染，而且水解出的牛奶经过超高温灭菌后，有明显的褐变； 流程2虽然可以减少微生物的污染，但所需的酶的用量大，水解出的牛奶经过超高温灭菌后，也容易褐变； 流程3是在牛奶超高温灭菌后罐装的同时加入乳糖酶，该工艺不会引起低乳糖牛奶的微生物污染和褐变，并且所需酶的用量少，可生产出乳糖水解率90%的低乳糖牛奶，能降低低乳糖牛奶的生产成本； 最终选择工艺流程3来生产高水解率的低乳糖牛奶。,低乳糖牛奶生产工艺的确定,工艺流程3优点 普通工艺添加乳糖酶不仅需要大量添加乳糖酶，同时还需要很长的工艺时间来水解乳糖，耗时耗电，水解的产品经加工后容易发生褐变，缩短产品货架期。 利用无菌在线添加技术极大地降低了乳糖酶的使用成本， 同时防止产品在货架期内发生褐变，延长了产品的货架期，货架期可以达到7个月。 用此工艺巧妙地利用了待检时间完成水解，使工艺操作中省去了水解时间，对于90的乳糖水解率，酶用量减少为原来的四分之一，极大地提高了工厂的利用率，降低了生产成本和管理费用。,
