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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ YAC 载体和体内标志系统对提高转基因效率有应用前景。(一) 特殊 DNA 序列的研究目前，转基因整合基因座具有位置效应已被公认。所谓位置效应即由于转基因的整合基因座不同，受其周围染色体侧翼区(如沉默子或增强子)的影响不同，从而导致转基因表达水平在不同系不一样。对位置效应有缓解作用的特殊的 DNA 序列包括基质接触区(matrixattachmentregions，MAR) 、基因座控制区(locuscontrolregion，LCR)及隔离子(insulator) ，这些 DNA 序列可通过特殊的分子机制来激活外源 DNA 的表达。MAR 序列是指细
2、胞核中与核骨架基质结合的 DNA 区段。其特点是富含 DNA 拓扑酶可切割的序列，对 MAR 序列可以提高基因表达效率的原因尚不是很清楚。鉴于 MAR 几个物种共同的特征是位于其机能转录的边界，因此推测 MAR 序列有可能通过核内因子(拓扑酶等) 使附近基因形成独立的调控元，从而屏蔽位置效应对KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 是另一类对基因表达有促进作用的特殊 DNA，其结构和机能在进化上是相当保守的。通过对几个物种 -珠蛋白附近 LCR 序列研究表明：LCR 序列使与其相连的外源基因在转基因鼠系中表现出非位点依赖型高效表达；LCR 与珠蛋白基因相互作用具有组织及发育特征性；LCR 影
3、响其下游近 200kb 区域染色体结构及DNA 复制模式；珠蛋白基因 LCR 具有组织特异性 DnaseI 超敏位点。综合实验推测，LCR 可以摒弃位置效应的主要原因可能是通过稳定其邻近染色体开放组织来起作用。(二)YAC 载体的应用某些表达问题可由在转基因构建中加入调控因子而解决，使用MAR 或 LCR 来的序列可产生拷贝数依赖及不依赖位置的转基因表达。然而并非所有基因都能与这些序列结合，而且可能距结构基因极远，超过转基因构建的大小。酵母人工染色体(YAC)载体是近年来发展起来的新型载体，它的大容量为处理大片段 DNA 提供了有力的武器。早在 1996 年，BremG 等就通过原核显微注射，
4、成功获得了整合有 250kb 包含小鼠酪氨酸激酶基因的 YAC 构建的转基因兔子，解除了转基因个体的白化症表型。但这个实验的成功当时并未引起足够重视，直到 1997 年，Fujiwara 等建立了 210kb 人类乳清蛋白 YACDNA 转基因小鼠，在乳腺获得人乳清蛋白的高水平表达，该载体才引起广泛关注，成为制备转基因动物的又一有力武器。其特点是不存在位置效应，因 YAC 载体的大容量能保证巨大基因的完KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 体内标志系统的应用目前，使用转基因生物一个最严重的问题是产生转基因动物的效率极低。解决这个问题的一个方法是发展一种着床前筛选转基因阳性胚胎的有效方法。遗
5、传报道基因系统是用于演示顺式作用的DNA 序列与反式作用的因子如何协同真核基因表达的一种替代方法。体内报道分子则是在活细胞或组织中进行的关于报道基因的分析。一般常用的报道基因产物包括细菌氯霉素乙酰基转移酶(CAT)及 -半乳糖苷酶等，但这些标记基因不能用于检测这些基因的活胚性。萤火虫荧光素酶基因也曾被用作显微注射的标记基因以利于筛选转基因胚胎，但该标记基因需要外源性的底物或辅助因子来检测表达，不能分辨胚胎中一过性的表达。绿色荧光蛋白(GFP)是一种来源于维多利亚水母的标记基因产物，GFP 是一种无毒、不需外源底物及辅助因子即可发出绿色荧光的蛋白。1997 年，Takada 等用 GFP 的一个
6、突变体 S65T 作为标记基因在囊胚阶段检测 55 枚阳性胚胎移植后，90的是转基因胚胎，但阴性胚胎移植后也有 20为转基因动物。因此，该法难以区分是一过性还是稳定表达。增强 GFP(EGFP)比野生型 GFP 信号强 35 倍。1999 年，MinoruKato 通过原核显微注射，将 CMV -actinEGFP 融合基因注入小鼠受精卵，体外培养至桑葚胚或胚泡，在荧光显微镜下观察并由 PCR 分析后显示：所有细胞KKME-专业医学搜索引擎 http:/ EGFP 者为转基因阳性，而嵌合表达 BGFP(即荧光信号不均匀)者大多不是转基因阳性。这些结果显示 EGFP 可作为选择转基因胚胎可靠的标
7、志。该标志系统地成功应用可大大提高转基因动物的生产效率，尤其是在大型农场动物的生产中有极大的应用前景。(四) 利用基因共转移提高基因表达效率利用基因共转移提高外源基因表达效率的途径又称基因拯救(generescue)，具体是将高效表达的基因结构与低效表达的基因结构共转移，其表达效率往往得到改善。共转移之所以能提高外源基因的表达效率，有可能是因为某些基因中存在增强子或隔离子序列，亦或是某些基因的转录激活同时带动其他基因的转录激活。共转移缓解外源基因的异染色质化，则可能涉及内元的存在，内元的存在可能使异染色质化受到某种程度的抑制。转基因技术的诞生是科学发展史上的一大创举，它标志着人类对生物遗传物质的工程操作已进入一个崭新的阶段。转基因动物体系是近年来发展起来的高新生物技术的结晶，随着细胞生物学、分子生物学、遗传学、发育生物学及动物胚胎学等相关学科的发展，该体系必将不断完善，深入发展，而该体系的不断完善及发展又必将为基础生物学科的发展及解决世界人口、粮食、环境及健康等重大问题提供良好途径。大头医生 http:/
