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1、消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏的保护作用,Team Members： 05级3班 朱颖婷 陈羽青 金颖 谢波 管小凤,前言,研究目的及内容,back,材料和方法,实验器材和药品,BL-420E生物机能实验系统 呼吸机 哺乳动物手术器械，注射器若干、丝线若干、试管 颅骨钻（电钻），配2mm、3mm、5mm、6mm钻头 兔台 离心机、分光光度计、水浴加热器，移液器 自制弹性导管、自制流水冷却计 20%乌拉坦，生理盐水，0.3肝素，消旋儿茶素，蒸馏水，BUN试剂盒，MDA试剂盒，无水乙醇，冰醋酸 back,自制弹性导管,back,自制流水冷却计,back,实验准备,1. 18只家兔（3只用于预实验）随机
2、分为3组:A：假实验组，4只；B：渐进性脑死亡模型不给药组，5只；C：渐进性脑死亡模型给药组，6只。2. 称重、耳缘静脉麻醉 (20%乌拉坦5mlkg)，仰卧位固定。back,脑死亡诱导,气管插管将家兔转换为俯卧位，开颅，建立脑死亡模型，呼吸机支持（频率45次min，潮气量31.0 ml，呼吸比1：1），心电检测家兔松绑，侧卧于兔台，行股静脉插管。心电检测半小时，稳定 back,药物干预及抽血检测,脑死亡给药组在脑死亡模型诱导成功并稳定半小时后耳缘静脉注射消旋儿茶素2.22mg/kg。 三组家兔分别在脑死亡稳定后1h，2h，4h，8h，12h的时候股静脉取血1.5ml。 血液样本滴加肝素20l
3、，以3500转每分钟离心15分钟，取血浆按试剂盒说明做MDA和BUN测定。,back,数据处理,用SPSS10.0进行统计分析各组间血浆丙二醛（MDA）和尿素氮（BUN）值进行t检验每组内每个时间点与前一个时间点进行t检验。,脑死亡模型成功率,11只家兔建立脑死亡模型B组1只未能维持12h，1只呼吸机误停死亡，1只因股静脉取血不成功放弃，但一直进行心电检测，能维持12h；C组1只因股静脉取血不成功放弃，但一直进行心电检测，也能维持12h，1只因橡胶管破裂，生理盐水渗出，模型建立失败。其余家兔在建立脑死亡模型后，机体循环维持12h，最终心率在100次/min左右。共有8只成功建立模型，故成功率为
4、72.7%。,指标数据,表1 各组不同时间点血浆BUN的变化(s),指标数据,back,表2各组不同时间点血浆MDA的变化(s),讨论-关于脑死亡模型的建立,脑死亡模型分两种：急性和渐进式。 急性脑死亡模型：多为模拟急性和重大的脑外伤以致颅内压在30-60s内急剧升高，但却往往导致血流动力不稳定和呼吸衰竭。 渐进式：则模拟颅内压缓慢上升，能使血流动力不稳定性减低且在整个脑死亡过程中保持血压正常4-6小时13。 所以，渐进性脑死亡模型供体自动调节血液循环的机会，最大限度地避免循环衰竭和不可逆的血压过低。,讨论-关于脑死亡模型的建立,本实验项目计划参照Pratshchke的渐进式脑死亡模型模型，采
5、用橡胶管（外径4.5mm）制造带球囊导管，以此代替Fogarty导管进行颅内膨胀加压，成功率有72.7%。 与文献12（789 的大鼠在维持机械性人工呼吸6 h的观察中，MAP始终在80100 mmHg水平）相比，成功率相近。但机体循环的维持未达到文献中的水平。,讨论-消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏的保护作用,肾是机体内最容易产生氧自由基的器官之一。14 肾脏组织中氧自由基的主要来源为肾脏固有细胞和浸润细胞。15许多免疫及非免疫的实验研究均已证实氧自由基在急性肾脏损伤中有重要作用。16在某些病理条件下，由于活性氧产生过多或抗氧化酶类减少或活性下降，则可引发链式脂质过氧化反应，损伤细胞膜，进而使细胞
6、死亡。17,讨论-消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏的保护作用,研究表明，脑死亡引起的缺血损伤是慢性排斥反应发生的非免疫因素，其产生的氧自由基影响肾脏的长期存活期。 一种是由氧自由基介导的器官血管内皮的损伤，血管壁重塑如平滑肌细胞迁移、分化和增生等；另一种是由氧自由基介导激活内皮细胞，引起炎症，最后导致急性排斥反应发生。18,讨论-消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏的保护作用,研究表明，儿茶素能够有效地清除- OH 与MDA，改善肾功能,减轻肾脏进行性损害。10 家兔静注给药的儿茶素在体内分布较广或提示其在某些组织中的分布程度较高，体内分布迅速并且消除很快。而内服给药，吸收迅速，但不完全19。 故本实验选择静
7、脉（耳缘静脉）注射给药。而本实验中所选药剂是一种新药消旋儿茶素，属儿茶素类物质，探索其对肾的保护作用及与抗氧化的关系正是此次实验目的所在。,讨论-消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏的保护作用,考虑到经费问题，我们选择以MDA、BUN为指标。丙二醛（MDA）是脂质过氧化物的降解产物，它的存在标志机体内有脂质过氧化过程的参与。MDA的含量可间接反映氧自由基的产生与组织的损伤程度测定血中NPN或BUN可以粗略估计肾小球的滤过功能，在肾功能不全时，BUN的增加比NPN快而明显，故目前临床上多测定BUN。尿素氮（BUN）的降低表明了肾脏功能的改善。,讨论-消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏的保护作用,从本实验结果中可以
8、看出，脑死亡可以造成肾脏损伤，血浆尿素氮（BUN）在各时间点都显著升高。应用药物消旋儿茶素后，尿素氮（BUN）有所下降但差异没有显著性。而血浆丙二醛（MDA）含量脑死亡与对照组呈大致相反的波动趋势，但脑死亡后不给予药物干预和给予药物干预对血浆丙二醛（MDA）含量的影响不大。,讨论-消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏的保护作用,所得结果与预想有所偏差，估计原因和教训总结如下： （1）本次实验中，消旋儿茶素的剂量（2.22mg/kg）不够。在其他研究儿茶素类物质，采用的剂量范围为30-300mg/kg20-22。而目前对于消旋儿茶素的研究在国内、国外都很少。因化学本质不同，故本次实验并未参考以往文献对其它
9、儿茶素类物质用量，而参考本校药理实验室正在进行的对消旋儿茶素在细胞水平的药效研究所用剂量，但效果不明显。,讨论-消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏的保护作用,（2）由于时间的限制，本次实验共做15只兔子，A组4只，B组5只，C组6只。且由于对股静脉插管后凝血水平估计不足及处理不成熟，造成有些时间点未采样，所以样本量不足，影响数据的精确性。,讨论-消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏的保护作用,（3）实验器材的精确性对于本实验的采集到的数据有很大影响，譬如本实验所用VIS-723G分光光度计对同一试剂进行重复测量时，会出现前后不一致的现象；且实验室器材有限，玻璃试管和比色皿需多次重复使用，由于无去离子水和试剂量不
10、够，导致润洗步骤不严格，对数据造成了一定的影响。,讨论-消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏的保护作用,（4）消旋儿茶素对肾脏保护作用的机制有很多，但本次实验由于资金的问题，只探讨了它与氧自由基的关系，但效果不明显。而且本实验只进行了BUN和MDA的测量，分别反映肾功能和抗氧化效果，单一指标具有不确定性。,讨论-消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏的保护作用,（5）由于时间有限，预实验积累经验不足，导致正式实验中，多次根据实际情况对实验方法进行调整，并没有保证所有家兔在同一实验条件下。这在一定程度上影响了实验结果的准确性。,讨论-关于实验拓展,（1）该剂量消旋儿茶素效果不明显，建议以后的研究可增加剂量。 （2）建
11、议以后实验中，对于同一方面进行多项指标的测定，如反映肾功能的指标增加对血肌酐（Br）的测定，对抗氧化水平增加SOD、活性氧等指标的测定，以消除单一指标的不确定性。 （3）增加测定指标以探讨消旋儿茶素的对肾脏保护的其他机制，如抗炎等。建议加入抗炎水平的测定，如测量TNF-和白介素水平等。,讨论-关于实验拓展,（4）在实验经费和实验时间的允许下，建议加大样本量，以减少个体差异及实验操作带来的误差。 （5）为确定消旋儿茶素对家兔肾脏保护作用的最小有效量，应进行预实验，设置不同剂量组予以确定其量效关系。 （6）可进行多种药物比较，确定最佳的一种，甚至可以尝试合用多种药物，发挥其中的协同作用增强药效。,
12、（7）可增加一些定性指标的测定，如对各时间点肾脏组织结构的变化的光镜或电镜观察等。BACK,结 论,消旋儿茶素对脑死亡家兔肾脏可能有一定的保护作用，但抗氧化的作用机制在该剂量上表现不明显，建议增加剂量，并探讨对肾脏的保护其它机制。,Acknowledge,感谢汪雪兰老师、李志慧老师、阮浩澜老师罗老师、余老师、邱老师、杜老师等生理实验室的老师们对我们的指导谢谢！,参考文献,1 Tullius SG VoLk lid Neuhaus P. Transplantation organs from marginal donors.Transplantation,2001.72(8):1314. 2 T
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