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1、1,第九章 临床常见病原体检测,川北医学院检验系 谢 宁,2,概 述,感染性疾病 凡由病原生物包括细菌、真菌、 病毒、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体或寄生虫侵入人体所致的疾病，统称为感染性疾病。,3,找到病原菌,感染性疾病,控制更有效！,4,临床病原体检查目的,确定感染的发生和性质。 在疾病早期提供恰当的治疗方案，并采取有效的预 防措施。 防止感染传播所造成的危害。 病原体检查重要性：明确临床诊断 指导临床用药,5,临床病原体检查的基本程序,医生、护士、病人、检验师：正确规范采集运送标本。 检验科：直接镜检、免疫学、分子生物检测、病原体 分离培养鉴定和药敏实验报告结果。 医生：明确诊断、合理
2、用药。,6,第一节 标本的采集运送、实验室评价和检查方法,7,一、标本采集和运送,无菌操作,采集时间、部位,8,检验申请单的基本内容,The patient,s name and hospital number. Age and sex. Collection date and time. Diagnosis. Source of the specimen. Ordering physician. Immunization history and antimicrobial therapy. Objective.,9,（一）血液标本的采集,适应症 采集时机 皮肤准备 培养瓶消毒 采血量 采血套
3、数 振摇 室温送检,10,（二）尿标本的采集,晨起第一次尿液为佳 冲洗外阴部、尿道口 清洁中段尿 导尿 耻骨穿刺采集膀胱内尿液 不得加防腐剂和消毒剂,11,（三）粪便标本的采集,自然排便，挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检。 排便困难者，采用直肠拭子采集。 根据细菌种类不同选用合适的运送培养液以提高阳性检出率。 传染性腹泻应连续送检3次。,12,(四) 呼吸道标本的采集,13,痰标本的采集,采集时间：晨痰，且在取痰 前用清水反复漱口。 方法： （1）自然咳痰法：（2）气 管镜下采集法；（3）气管 穿刺法。,14,要求：10个鳞状上皮细胞/低倍 25个WBC /低倍,15,（五）脑脊液与其他无
4、菌体液标本,无菌注射器穿刺采集，置于无菌容器中立即送检。 脑脊液标本应立即保温送检，不能暂时保存于冰箱中。 第一管用于微生物学检查。 胸腹水等体液标本应抽取2-5ml送检。,16,（六）泌尿生殖道标本的采集,常取生殖道分泌物 男性：无菌采集尿道口分泌物或前列腺液。 女性：用无菌棉签采集阴道或宫颈分泌物。 生殖道疱疹常穿刺取疱疹液,17,（七）脓液及创伤感染分泌物标本,18,脓液及创伤感染分泌物标本,开放性脓肿及脓性分泌物： 直接涂片染色镜检 用NS冲洗表面两支无菌棉拭取脓液或深部分泌物 分离培养 封闭性脓肿： 灭菌试管 一般细菌培养 消毒皮肤粘膜注射器无菌抽取脓液 厌氧送检供厌氧菌培养 大面积
5、烧伤的创面分泌物： 无菌棉拭取多部位创面脓汁分泌物无菌试管送检。,19,二、标本的实验室质量评估标准,无标签的标本或标签信息与申请单信息不一致； 送检日期延误的标本； 容器有破损或渗漏等； 标本储存、运送方式不当； 明显污染标本； 量明显不足标本； 重复送检标本（血培养除外） 烈性传染病标本的采集和运送不符合相关规定,拒 收,20,三、检查方法,直接显微镜检查。 病原体抗原与抗体的检测。 病原体核酸的检测。 病原体的分离培养与鉴定。,21,（一） 直接显微镜检查,不染色标本检查法：悬滴法和压滴法 染色标本检查法： 革兰染色：细菌、真菌 抗酸染色：抗酸杆菌（结核、麻风） 墨汁染色：隐球菌,22,
6、23,直接显微镜检查的优缺点,优点：快速诊断或初步诊断。 缺点：不能准确鉴定细菌真菌的属和种；未进行药 敏试验，不能准确指导临床抗生素治疗。,24,（二）病原体抗原检查,方法：免疫荧光、酶免、化学发光等。 排除交叉抗原的影响，病原体抗原检测可明确感染的病原体,HIV抗原检测实验原理示意图,25,（三）血清学实验,特异性 IgM可作为感染性疾病 早期诊断指标，且可区分原 发与复发感染。 特异性 IgG，尤其双份血清的 滴度呈4倍或4倍以上升高，考 虑病原体感染。,26,（四）病原体核酸的检测,聚合酶链反应（PCR）：扩增 病原体微生物特异的DNA或RNA 片段。 探针杂交法：通过已知序列的 探针
7、与病原体的核苷酸杂交， 用以了解病原体的有无。 主要适用于不能或很难分离培 养的微生物。,27,（五）病原体的分离培养与鉴定,目的： 明确感染病原体。 为临床提供体外抗微生物药物敏感试验结果。,28,细菌、真菌：选择合适的培养基与培养方法、观察 菌落性状、生化鉴定、血清学实验。 病毒、立克次体、衣原体：接种鸡胚、易感动物或 进行细胞培养，观察增殖指标和血清学方法鉴定。,29,细菌感染检测程序,30,病实 毒验 感室 染诊 性断 疾 病 的,31,细菌分离培养与鉴定的结果评价,培养阴性,培养阳性,32,第二节 病原体耐药性检测,33,抗生素耐受的起点：盘尼西林,年 弗莱明 Fleming,年 弗
8、洛里 Florey & 钱恩 Chain,34,耐药性的历史,1941 青霉素 1960 甲氧苯青霉素 1943 链霉素 1962 林可霉素 1945 头孢菌素 1962 喹诺酮类 1950 四环素 1970 青霉烯类 1952 红霉素 1980 单环-内酰胺类 1956 万古霉素 2010 抗生素时代的终结？,超级细菌！,35,可以预测药物在病人体内的效果，指导临床合理选择 抗生素； 了解本地区或本医院内常见病原菌的种类及耐药性， 有助于临床经验性治疗时合理选药。 定期对病原菌种类和耐药谱分析，有助于发现医院感 染暴发或流行。,细菌药敏检测的意义,36,定义：对某种抗菌药物敏感的细菌变成对该
9、药物耐受称 细菌耐药性。 类型： 天然耐药：是通过染色体DNA突变所致。 获得性耐药：是由质粒介导、转位因子的插入以及其他遗 传物质携带外来DNA片段导致产生的耐药性。,细菌耐药性,37,细菌水平和垂直传播耐药基因的整合子系统； 产生灭活抗生素的水解酶和钝化酶； 细菌抗生素作用靶位改变； 细菌膜外排泵出系统； 细菌生物膜的形成。,细菌产生耐药的常见机制,38,39,K-B纸片琼脂扩散法 稀释法： E试验 MIC （最低抑菌浓度）,药敏检测的方法,40,药敏实验结果的解释,根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准判断： 敏感（susceptible，S):表示推荐使用该抗生素进行临床 治
10、疗。 耐药(resistant，R):指常规用药剂量不能达到MIC，临床 治疗不可靠。 中介(intermediate，I):表示药物MIC接近体液或组织可达到药物浓度，但反应低于敏感株；但在一些浓集部位（如尿液中的喹诺酮类）或者使用高于正常给药量时临床上使用有疗效。,41,（1）耐甲氧西林葡萄球菌（MRS） （2）产超广谱-内酰胺酶(ESBL) （3）氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌（HLAR） （4）耐万古霉素肠球菌（VRE）,特殊耐药菌检测的临床意义,42,（1）耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）MRSA+MRCNS NCCLS规定：MRS对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和含酶抑制剂的复方制剂均
11、应报告耐药，而不考虑体外药敏结果，治疗首选药物为万古霉素。,特殊耐药菌检测的临床意义,43,44,（2）产超广谱-内酰胺酶(ESBL)： 该酶水解青霉素、头孢菌素及单胺类，主要由大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌产生。 NCCLS规定：产ESBL细菌,不论体外药物敏感试验结果如何, 对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南治疗均无效，建议用碳青酶烯类抗生素。,特殊耐药菌检测的临床意义,45,46,（3）氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌（HLAR） NCCLS规定:HLAR指对高浓度庆大霉素或链霉素耐药，提示与细胞壁活性药物无协同作用。,特殊耐药菌检测的临床意义,47,48,（4）耐万古霉素肠球菌（VRE
12、） VRE临床上可用药物很有限，可以对氯霉素（或强力霉素、二甲胺四环素）和利福平做药敏实验。但是对青霉素敏感的VRE可用青霉素和庆大霉素联合治疗；若对青霉素耐药而不是HLAR可以用壁霉素+庆大霉素。,特殊耐药菌检测的临床意义,49,第三节 临床感染常见的病原体检查,50,细菌感染检查项目的选择,普通细菌：常采用直接镜检、分离培养与鉴定明确病原体。 难培养或培养要求高的细菌：综合运用免疫学或分子生物 学检测，如结核分枝杆菌感染以及幽门螺杆菌感染等。 流行病学调查：病原体抗体检测，如ASO试验与Widal反应等。,51,病毒感染检查项目的选择,细胞培养快速复制的病毒：细胞培养。 细胞培养不能快速复
13、制的病毒：目前多检测病毒抗原、特异性抗体或核酸，如CMV。 不能细胞培养的病毒：病毒核酸检测与病毒特异性抗 体检测，如HCV、HPV等。,52,真菌感染检查项目的选择与应用评价,直接显微镜检查：初步明确真菌感染 分离培养：明确何种真菌感染 真菌抗原检测：只适合于血清与脑脊液中隐球菌、念珠菌以及荚膜组织胞浆菌等 真菌抗体检测：深部真菌的检测,53,寄生虫感染检查项目的选择与应用评价,直接显微镜检查：观察寄生虫生活史的各阶段，是寄生虫感染的主要诊断依据。 寄生虫抗体检测：辅助诊断。,54,支原体感染检查项目的选择与应用,直接显微镜检查：无价值。 分离培养：阳性可明确诊断。 目前临床多检测支原体抗原
14、 与核酸，用于早期快速诊断。,55,衣原体感染检查项目的选择与应用,直接显微镜检查：检查衣原体 包涵体可提供早期初步诊断。 分离培养：阳性可明确诊断。 目前临床多检测衣原体抗原与 核酸，用于早期快速诊断。,56,螺旋体感染检查项目的选择与应用,直接显微镜检查有初步诊断价值。 特异性抗体的检测为确诊依据。,57,第四节 病毒性肝炎检测,58,肝炎病毒标志物检测,甲型肝炎病毒（HAV） 乙型肝炎病毒（HBV） 丙型肝炎病毒（HCV） 丁型肝炎病毒（HDV） 戊型肝炎病毒（HEV） 庚型肝炎病毒（HGV） 输血传播病毒（TTV）,59,1.抗-HAV IgM型Ab阳性：可诊断为急性甲型肝炎。 2.抗
15、-HAV IgG型Ab阳性：表示过去曾受过HAV感染， 但体内已无HAV，是一种保护性抗体，可用于甲 肝的流行病学调查。 （对HAV的检测还有HAV-RNA，其诊断特异性高， 特别是对早期诊断意义更大。）,一 、HAV抗体检测,60,二、HBV血清标志物检测,HBV 特点：又称Dane颗粒，嗜肝性DNA病毒，分为包膜与核心两部分：包膜上的蛋白质即HBsAg；核心部分含双链DNA、DNA聚合酶（DNAP）、核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg），是病毒复制的主体。,61,1、乙肝两对半检测 （1）HBsAg:表面抗原 为HBV的主要外壳蛋白，包括前S1、前S2和S蛋白，具有抗原性，HBsA
16、g阳性表示存在HBV的现症感染，为HBV感染最早证据。 HBsAg阳性见于急性乙肝潜伏期；发病后3个月不转阴，则易发展成慢性乙型肝炎或肝硬化。携带者HBsAg也呈阳性。HBsAg本身不具有传染性，但因其常与HBV同时存在，常作为传染性标志之一。,62,（2）抗-HBs：表面抗体 抗-HBs是一种保护性Ab（中和性抗体，能中和HBsAg ），抗-HBs阳性提示机体有一定免疫力。一般在感染后3-6个月才出现，可持续多年。注射过乙型肝炎疫苗或抗-HBs免疫球蛋白者，抗-HBs可呈现阳性反应。,63,（3）HBeAg： e抗原 HBeAg阳性是HBV复制的标志，表明乙型肝炎处 于活动期，提示HBV在体内复制，传染性较强； HBeAg持续阳性，表明肝细胞损害较重，且可转 为慢性乙型肝炎或肝硬化。如转为阴性，表示病 毒停止复制 。,
