《神经生理学激素递质5ht儿茶酚胺检测课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《神经生理学激素递质5ht儿茶酚胺检测课件（25页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、儿茶酚胺类神经递质及检测方法,儿茶酚胺类神经递质：是一类广泛存在于中枢和外周神经系统中的单胺类神经递质，主要包括去甲肾上腺素（NA）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）。,儿茶酚胺的生物合成：苯丙氨酸 TH AADC 食物 酪氨酸 L-多巴 多巴胺 DBH PNMT 去甲肾上腺素 肾上腺素TH：酪氨酸羟化酶 AADC：多巴胺脱羧酶 DBH：多巴胺羟化酶 PNMT：苯乙醇胺N甲基转移酶,影响儿茶酚胺生物合成的药物：1、前体剂： 酪氨酸 L-多巴2、生物合成酶的抑制剂：TH抑制剂：-甲基酪氨酸 AADC抑制剂：甲基多巴肼、苄丝肼 DBH抑制剂：双硫醒 PNMT抑制剂：2、3-二氯- -甲基苄胺
2、,相关的疾病：,1、帕金森病（Parkinsons disease PD)是中枢神经系统常见的退行性病变，临床上主要表现为静止性震颤、运动减少和肌强直等。主要的病变部位在大脑的黑质和纹状体，表现为DA能神经元减少，另外黑质、蓝斑和迷走神经背核的神经元减少，黑质有不同程度的胶质的增生，纹状体中的DA和其代谢产物高香草醛酸明显减少，5-HT、NA、GABA(-氨基丁酸）也降低。,有趣的发现：吸烟与PD的发病呈负相关性，吸烟对PD有保护作用，吸烟和咀嚼尼古丁、口香糖能暂时改善PD病人震颤、僵直及运动迟缓的症状。实验证明尼古丁能刺激脑内DA、NA、5-HT的释放，诱导神经生长因子mRNA的表达，增加大
3、脑对葡萄糖的利用,2、吗啡依赖：近年提出的吗啡依赖性机制的复合学说，从神经环路上解释依赖性机制。该学说认为，依赖性形成是不同脑区对吗啡适应后产生的综合效应，并认为在不同阶段有不同的神经化学过程的不同变化。,在动物实验中证明：,单次给予吗啡后，VTA（腹側被盖区）放电和DA的释放增加，LC（蓝斑核）放电及NA释放减少，ACh和GABA释放减少；在反复给予吗啡后，这些变化都不明显，即产生耐受性。在戒断症状出现时，VTA放电减少，NAS（伏隔核）和腹側纹状体DA释放减少，而LC放电及NA释放增加，Ach释放增加，GABA释放仍减少,检测方法：,1、组织化学法 2、荧光法 3、高效液相色谱法 4、激光
4、诱发荧光毛细管电泳,激光诱发荧光毛细管区带电泳检测儿茶酚胺类神经递质的优点： 微量 快速分离 高分辨能力 高灵敏度,检测原理：,荧光衍生剂与氰化物存在的氨基酸起反应产生一种强烈的荧光复合物，通过激光诱发荧光毛细管电泳进行检测。,样品的收集：,采用脑微透析技术，在麻醉或清醒的动物中通过立体定位相应的部位插入微透析探针，用人工脑脊液低速灌流，0.2 l/min为最好，可以避免神经组织的干扰。同时加入0.35 l的0.1M高氯酸，防止NA和DA的氧化。,实验的条件：,一、毛细管电泳 1、毛细管的选择：毛细管的长度为70cm，内径为50 m 2、激发波长442nm，发射波长490nm 3、输入电压为1
5、5KV 4、每一次电泳进行前，用0.1M氢氧化钠、水、最后用分离液冲洗,二、试剂的配制,所需的试剂： 500mM硼酸钠缓冲液(PH8.60) 110mM磷酸钠缓冲液(ph7.00) 5mM NDA 10mM 氰化钠 0.1M 磺基丙氨酸 1mM标准液（含NA、DA、DHBA、乙胺、氨基酸混合物、0.1M的高氯酸）,配试剂时的注意点：,1、所有用于实验的试剂都必须是分析纯及以上的级别，配试剂需用去离子水 2、注意各试剂的保存时间：NDA、氰化钠、磺基丙氨酸在4可以保存一星期左右。标准液配好后置于20 保存。 3、NDA易发生氧化，因此配时要避光，分装时用氮气充溢整个容器。 4、整个操作过程中要注
6、意NDA要放置于冰浴中，防止甲醇溶液的挥发。,衍生化步骤：,1、普通衍生化的步骤：750 l NA和DA的标准液（含10-6M乙胺和10-7M DHBA）或样品，加入100 l 500mM硼酸钠缓冲液(PH8.60) ，90 l 10mM 氰化钠溶液，10 l 5mM NDA，振摇后，在室温下反应15分钟，接着加入50 l 0.1M 磺基丙氨酸终止反应。,2、微透析样品的衍生化：加入0.5 l 500mM硼酸钠缓冲液(PH8.60) ，0.45 l 10mM 氰化钠溶液，加入3.6 l 的透析样品，收集用0.35 l 的高氯酸，0.1 l 5mM NDA，振摇后，在室温下反应15分钟，接着加入
7、0.25 l 0.1M 磺基丙氨酸终止反应。同时用标准液取代透析样品制作标准曲线。,反应体系中加入磺基丙氨酸的作用：去除过量的NDA和乙胺，使次产物的形成减少到最低。,检测结果,1、当DA和NA的衍生化浓度在10-6- 10-9M浓度时的直线回归的相关性较好。 2、随着分离缓冲液（110mM磷酸钠缓冲液）的PH值从8.85下降至7.00，DA和NA 的分离效率增加，在PH7.00时效率最佳 3、反应体系中硼酸钠缓冲液的浓度在50mM时，DA和NA之间的分辨能力最大，有较高的分离效率。,最近我们用NDA做衍生剂检测了谷氨酸，制作了标准曲线并检测了其中的一个微透析样品。标准曲线的直线回归的相关性 R=0.9995。明显优于用FITC作衍生剂的检测结果，且衍生时间短。,谢 谢,
