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1、猪精液冷冻保存技术,吉林省农业科学院 李兆华,内 容,猪精液冷冻保存的意义 猪精液冷冻技术研究概况 猪精液冷冻技术操作流程 影响猪精液冷冻效果的因素 如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力,1、延长公猪使用年限； 2、获得更大的遗传进展； 2、取代活体公猪的引进； 3、生物安全的保证。,猪精液冷冻保存的意义,从意大利人Spallanzani最早开始研究哺乳动物精液冷冻开始至己有200多年的历史 。猪的精液冷冻研究是从1949年英国人Polge等发现甘油(丙三醇)对牛精子具有抗冻保护作用后开始的。1956年，他首次报道了应这个原理进行猪精液的冷冻操作，并进行人工授精。1957年Hess等将猪冻精经子宫
2、颈输入，并产下仔猪。 1975年，Pursel等发明了简便的猪精液冷冻和解冻方法，从此打开猪冷冻精液的商品化之路。 （用颗粒状冷冻精液给23头青年母猪输精, 48h后剖检11头,有5头受孕; 25-30d后剖检另外12头,有10头怀孕）,猪精液冷冻技术研究概况,猪精液冷冻技术研究概况,我国从70年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索。 1975年西安市草滩农场试配了8头母猪 。 1977年成立了全国猪冻精协作组。 1986年冷冻精液累计配种母猪6万余头， 近几年： 甘肃农业大学 张兆旺教授 南京农业大学 芮荣教授 西北农林科技大学 李青旺教授 四川农业大学 马恒东教授 东北农业大学 刘娣教授 上
3、海农科院 张德福研究员,猪精液冷冻技术操作流程,精液采集质量检测第一次稀释降温、平衡 （15， 5 ）第二次稀释平衡冷冻保存,猪精液冷冻技术操作流程,颗粒法冻精的冷冻程序 1)新鲜精液在常温、等温条件下，用不含甘油的I液稀释，然后平衡0.52h; 2)缓慢降温至15维持4h，再从15经1h降至5; 3)用等温的含甘油的II液进行稀释。 4)稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。利用广口液氮罐，以聚四氟乙烯板作为冷冻面，冷冻面与液氮面距离为12cm，待冷冻面充分预冷后，用预冷的滴冻管在氟板上连续等量滴冻。其始冻温度为-110-125，滴冻时间控制在60s内完成，加盖熏蒸平衡34 分钟后，浸入液氮中保存
4、。细管法和塑料袋法的冷冻程序 1)新鲜精液在室温下，用稀释液将精液按比例等温稀释，然后平衡0.52h。 2)将精液移入15条件下降温平衡3h。 3)在15条件下离心(800g，10min), 加入无甘油的I液，缓慢降到5，平衡2h，加入含甘油的II液，然后分装。 4)程序冷冻仪冷冻：初始温度为5，以3min从5降到-5，再于-5条件下保持1min结晶，然后以50min从-5降到-140，然后投入液氮保存。 5)液氮熏蒸冷冻：在广口液氮罐内，与液氮面距离5cm处，熏蒸20分钟，然后投入液氮保存。,影响猪精液冷冻效果的因素,个体的影响个体对精液冻后效果影响极大。应用限制性片断长度多态(AFLP)分
5、析控制精子冷冻能力的基因，没有发现差异。差异的机制仍需要继续研究冻前处理的影响冷休克：可能原因是质膜中特别的组成成分所致。猪精子膜磷脂酰胆碱的含量较牛低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量高胆固醇/磷脂的比例低，且胆固醇的分布不对称，外膜的分布量大于内膜离心：800g，10min,影响猪精液冷冻效果的因素,冷冻保存承载工具的影响承载工具：颗粒、0.25mL、0.5mL小型细管和扁平细管；5mL 的大型细管5mL塑料袋。如FP(Flat-Pack，300mm22mm0.2mm)和MFP(a multiple Flat-Pack)。冷冻解冻程序的影响冷冻速率：3050/min。解冻速率：12001800
6、/min冷冻 0.25mL微型细管：50/min、1.5甘油浓度；0.5mL小型细管：30/min、3甘油浓度；5mL大型细管：16/min 、3.3甘油浓度。解冻 0.25mL、0.5mL细管：50，12s或37，20s；5mL细管：50，40s5mL塑料袋：50，13s,影响猪精液冷冻效果的因素,稀释液的组成大体上，包括糖，蛋白质，脂类，缓冲剂，冷冻保护剂和一些添加物质。渗透压的影响最佳渗透压：420580mOsm/Kg为最佳渗透压糖的影响双糖（半乳糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖等） 顶体完整率；单糖（尤其是果糖和木糖） 精子冻后活率。配合使用效果比单一使用好,影响猪精液冷冻效果的因素,冷
7、冻保护剂的影响常用：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)、木糖醇、乙酰胺、阿东糖醇等。作用过程：（1）冲淡溶液中溶质盐浓度，细胞摄入盐量减少，由抗冻剂代替；（2）抗冻剂进入细胞，改变了胞内过冷状态，使胞内压接近胞外压，降低了细胞脱水皱缩程度和速度；（3）抗冻剂进入细胞，缓解了精子在解冻时的渗透性肿胀引起的损伤。效果：甘油保护效果最好，但有毒。方向：联合使用，最终除去甘油,影响猪精液冷冻效果的因素,添加物的影响缓冲：磷酸二氢钾、柠檬酸钠、Tris等；抗菌：青霉素、链霉素等；洗涤剂：OEP（氨基-钠十二烷基硫酸酯）、SDS（十二烷基硫酸钠）等；抗氧化：维生素E、GSH（谷胱甘肽）等激素类：PGF2a其他：透明质酸、N-乙酰基-D-氨基葡糖等,影响猪精液冷冻效果的因素,抗氧化剂在猪精液冷冻保存上的应用研究,如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力,选择优良的个体稀释液中要添加抗氧化的物质 BHT,GSH,SOD,过氧化氢酶，VE等。输精时间要尽可能和排卵时间吻合提高输精精子剂量,谢谢大家,
