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1、豚鼠环磷酸腺苷豚鼠环磷酸腺苷(cAMP)酶联免疫分析酶联免疫分析试剂盒使用说明书试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用本试剂盒仅供研究使用 产品编号：产品编号：CSB-E12068Gp 检测范围：检测范围：156 pmol/ml - 10000 pmol/ml 最低检测限：最低检测限：39 pmol/ml 特异性：特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的豚鼠 cAMP，且与其他相关蛋白无交叉反应。 有效期：有效期：6 个月 预期应用：预期应用：ELISA 法定量测定豚鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中 cAMP 含量。 说明说明 1试剂盒保存：-20（较长时间不用时） ；2-8（频繁使
2、用时） 。 2浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造 成任何影响。 概述概述 环磷酸腺苷（3-5-cyclic adenosine monophosphate，cyclic AMP，cAMP）是一种具有 细胞内信息传递作用的小分子，被称为细胞内信使（intracellular messenger）或第二信使 （second messengers） 。cAMP 是具有传递含氮激素作用的重要物质。当含氮激素从某一细 胞分泌后随体液运行到靶细胞，作用于
3、细胞膜上的特异受体时，激活细胞膜内的腺苷环化 酶，此酶在 Mg2+或 Ca2+存在的条件下，使细胞中的三磷酸腺苷（ATP）转化为 cAMP，再 由 cAMP 激活蛋白质激酶，由蛋白质激酶再激活多种酶系而起强大的生理效应。故称含氮 激素为第一信使，cAMP 为第二信使。cAMP 广泛存在于各种细胞中，对细胞的功能和代 谢起着重要的调节作用。 实验原理实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗 cAMP 抗体的微孔中依次加入标 本或标准品、生物素化的抗 cAMP 抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化
4、成最终的黄色。 颜色的深浅和样品中的 cAMP 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值） ， 计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板酶联板(Assay plate )：一块（96 孔） 。 2.标准品标准品（Standard）：2 瓶(冻干品)。 3.样品稀释液样品稀释液(Sample Diluent)：120ml/瓶。 4.生物素标记抗体稀释液（生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：110ml/瓶。 5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 （HRP-avidin Diluent）：
5、110ml/瓶。 6.生物素标记抗体（生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1120l/瓶（1：100） 7.辣根过氧化物酶标记亲和素（辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1120l/瓶（1：100） 8.底物溶液（底物溶液（TMB Substrate）：110ml/瓶。 9.浓洗涤液（浓洗涤液（Wash Buffer）：120ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。 10. 终止液（终止液（Stop Solution）：110ml/瓶（2N H2SO4） 。需要而未提供的试剂和器材需要而未提供的试剂和器材 1.标准规格酶标仪 2.高速离心机 3.电热恒温培养箱
6、4.干净的试管和 Eppendof 管 5.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6.蒸馏水，容量瓶等 标本的采集及保存标本的采集及保存 1.血清：全血标本请于室温放置 2 小时或 4过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即 可检测，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。 2.血浆：可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2 - 8 C 1000 x g 离心 15 分钟，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。 3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将标本 放
7、于-20或-80保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 标本的稀释原则：标本的稀释原则： 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标 准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算 浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。 标准品的稀释原则：标准品的稀释原则：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml，盖好后静置 10 分钟以上， 然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为 10000 pmol/ml，做系列倍
8、比稀释后，分别稀释 10000 pmol/ml，5000 pmol/ml，2500 pmol/ml，1250 pmol/ml，625 pmol/ml，312 pmol/ml，156 pmol/ml，样品稀释液直接作为标准浓度 0 pmol/ml，临用前 15 分钟内配制。 如配制 5000 pmol/ml 标准品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）10000 pmol/ml 的上述标准品加 入含 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 生物素标记抗体的稀释原则：生物素标记抗体的稀释原则： 临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次
9、实验所需的总量配制 （每孔 100l） ，实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如 10l 生物素标记抗体加 990l 生物素标 记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则： 临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需 的总量配制（每孔 100l） ，实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如 10l 辣根过氧化物酶标记亲 和素加 990l 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时 内配制。 操作步骤操作步骤 实验开始前，请提前配置好所有试剂，
10、试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起 泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品 符合试剂盒的检测范围。 1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100l，余孔分别 加标准品或待测样品 100l，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量 不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37反应 120 分钟。 为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。 2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100l（取 1l 生物素标 记抗体加 99l 生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小
11、时内配制），37,60 分钟。 3.温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟，350l/每孔， 甩干。 4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100l，37， 60 分钟。 5.温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟，350l/每孔， 甩干。 6.依序每孔加底物溶液 90l，37避光显色（30 分钟内，此时肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔梯度不明显，即可终止） 。 7.依序每孔加终止溶液 50l，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。终止液的加入顺序应尽 量与底物液的
12、加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快 加入终止液。 8.用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD 值） 。 在加终止液后 15 分钟以内 进行检测。 注注： 1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。 2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及 2N H2SO4。测量时先用此孔调 OD 值至零。 3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。 4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于 2-8保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根 过氧化物酶标记亲和素工作液请
13、依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标 准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。 5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。 洗板方法洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水 纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟。 根据需要，重复此过程数次。 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 计算计算 以标准物的浓度为横坐标（对数坐标） ，OD 值为纵坐标（普通坐标） ，在半对数坐标纸上 绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线
14、查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标 准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计 算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 注意事项注意事项 1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。 2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。 3. 一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。 5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。 6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。 7. 底物请避光保存。 8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
