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1、第八章,微生物制药,第一节 微生物药物的产生菌,微生物产生的药物以抗生素为主，还有氨基酸、酶类和维生素类等多种药物。自从抗生素应用于临床以来，已报道的抗生素已有一万种左右，每年以百计增加，已应用于临床的抗生素有一百多种，在人类治疗和预防疾病方面作出了巨大的贡献。主要应用于抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗原虫和抗动植物病毒等方面。,抗生素在临床应用中面临的问题,细菌耐药性逐年增加，疗效逐渐下降甚至无效，导致了治疗感染性疾病中的严重问题，通过新抗筛选来解决现在面临的情况。,在筛选过程中要考虑两方面的问题：,一是代谢产物的产生，尽可能发现新抗及产生菌； 二是代谢产物的活性检测要有灵敏的检测方法和手段。,新微
2、生物药物的筛选过程,药物的产生菌,细菌； 放线菌（目前发现的10000种左右的活性物质种有23是由放线菌产生的）; 丝状真菌。,细菌，临床应用的由细菌产生的有价值的抗生素并不多，多为多肽类药物。杆菌肽、粘菌素、多粘菌素。,青霉素、头孢菌素、灰黄霉素。 青霉素，内酰胺类抗生素，抑制细胞壁的合成，作用于转肽酶和羧肽酶。 灰黄霉素抑制真菌的生长，使细胞停止分裂。,放线菌产生的药物主要是抗菌药，其次是抗肿瘤药,（1）内酰胺类抗生素：抑制细胞壁的合成。 （2）氨基糖苷类抗生素，临床应用较多广谱抗细菌，作用机制是抑制细菌蛋白质的合成。链霉素、卡那霉素、庆大霉素。,（3）四环类抗生素，广谱抗细菌，抑制蛋白质
3、的合成，与30s小亚基结合，抑制氨酰tRNA与核糖体A的结合，阻断肽链延长。四环素、金霉素、土霉素。 （4）大环内酯类抗生素，抗革兰氏阳性细菌，支原体和衣原体。与50s大亚基结合，抑制转肽反应，阻断蛋白质的合成。红霉素、螺旋霉素。,（5）紫霉素类抗生素，抗革兰氏阳性和阴性细菌，结核杆菌，与30s和50s亚基结合，抑制蛋白质合成的起始反应和肽链延长中肽基tRNA的转移。如紫霉素、结核放线菌素。 （6）糖肽类抗生素，抗革兰氏阳性细菌和金黄色葡萄球菌，抑制细胞壁粘肽的合成。如万古霉素。,（7）多烯类抗生素,作用于真菌，与细胞膜中的固醇结合，膜受损，胞内的一些物质钾离子、氨基酸和核苷酸外漏，影响正常代
4、谢，细胞死亡。两性霉素、制霉菌素。 （8）其他利福霉素（抑制RNA聚合酶从而抑制转录）、氯霉素（抑制蛋白质的合成）、磷霉素（抑制肽聚糖前体的形成）。,新药产生菌的分离,采集样品分离微生物发酵活性物质筛选活性物质的分离纯化和鉴别临床前药理、临床试验开发研究,第二节 微生物药物产生菌的获得,一、利用微生物生产药物的优越性 微生物分布广，种类多，易变异，次级代谢产物多样性和新颖性微生物是具有潜在治疗效用的新结构化合物的无穷源泉。,二、微生物的来源,土壤，海洋，河，湖，极端环境和枯树叶，堆肥。,三、土壤微生物的分离,（一）、采集样品 不同来源的土壤中，微生物的种类和数量有很大的差异，含有机氮较多的中性
5、土中，放线菌和细菌较多。 含有机氮较少的酸性土中，真菌较多。 040厘米深处土壤中微生物的垂直分布： 真菌，地表00.3米；放线菌和细菌，01米，80在010厘米。,采样，5厘米以下，未开垦土地为佳，不同地理和生态环境，不同植被或不同质土壤对放线菌的种类，数量影响较大，南方放线菌种类比北方多，适宜季节为春秋季。,（二）、分离,1、样品的处理 温度：40100度，高温处理，得到不同种类放线菌。 化学试剂：SDS酵母浸膏，减少细菌5590，将风干土壤与碳酸钙26度培养79天，再分离，放线菌数量增加100倍。 物理：离心，16000转，离心20分，上清液主要是放线菌的孢子，沉淀为细菌、真菌孢子。,2
6、、分离培养基 高氏一号，查氏培养基，特殊培养基。 3、抑制剂的应用 目的菌是放线菌，培养基中加入抗真菌的试剂，抗细菌的青霉素或链霉素。,4、分离方法 稀释法、干土喷射法喷土机 5、培养条件 酸度，温度，2530度，714天。 6、挑选 单菌落传斜面。,（三）、新微生物药物的筛选,初筛： 合适培养基及条件利于产生次级代谢产物。 培养方式：固体，琼脂块转到活性测定平皿中；液体，发酵液，测抗菌活性。,筛选模型的要求：高专一性，高选择性，高敏感性，快速反应性，高稳定性。 1、常利用敏感菌作检定菌的琼脂扩散法； 2、抗生素耐药突变株。 找到有某种活性的出发菌株。,复筛： 作平行样，多次实验，确证其所产活
7、性物质的能力和稳定性。,（四）、产生菌的改良,1、自然选育：对于退化、产量下降，菌种不纯等现象，常进行自然选育进行纯化。 2、诱变选育：诱变剂有物理和化学两类，物理诱变剂常为紫外线、X射线，激光等；化学诱变剂主要是烷化剂、碱基类似物等。,3、杂交育种：优良性状的集中体现，原生质体融合遗传物质的交换重组，再生后得到正常菌株。 4、基因工程改良菌种：目的基因，载体，重组体，产量增加。,第三节 微生物药物的生物合成,（一）、微生物的代谢 微生物代谢是指微生物体内的化学反应（包括合成和分解代谢）。 根据微生物在体内代谢过程中产生的代谢产物在机体的不同作用，可分为初级和次级代谢物。,初级代谢物使营养物转
8、变为机体的结构物质和对机体具有生理活性作用的物质。包括供机体进行生物合成的各种小分子单体，前体和多聚物。如酶、氨基酸等。,次级代谢物存在于某些生物中（植物和微生物），并在一定的生长期内出现的一类代谢类型，对基本生命活动几乎无作用，产量较低，但他们在抵抗恶劣环境，伪装躲避，消除自身毒素等方面发挥作用，次级产物的合成途径和产物的结构通常使错综复杂、各不相同的，如抗生素、酶抑制剂、免疫调节剂、生长调节剂等。,（二）、次级代谢产物生物合成的基本特征,微生物药物是指由微生物在其生命活动中产生的具有生理活性的次级产物及其衍生物。包括：抗微生物感染和抗肿瘤的抗生素；酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、抗氧化剂
9、。,次级产物合成的基本特征,1、微生物的次级代谢是微生物生理、生化状态的体现，生长后期开始形成，当培养液中缺乏某种重要的营养物质而使细胞生长繁殖受到限制时，合成才启动； 2、以初级产物为前体，受初级调节，初级受阻，次级也不能合成；,3、一种底物可合成多种结构上完全不同的次级产物，不同微生物可合成相同的产物； 4、合成次级产物的酶系对底物的特异性不强，进行次级代谢的产生菌往往同时合成多种结构相似的次级产物； 5、次级合成过程中，有时控制次级产物合成的基因不仅位于染色体上，也可位于质粒上，质粒易缺失，次级产物合成不稳定。,（三）、微生物药物生物合成的基本途径,1、次级产物的生源次级产物中的构建单位
10、称之为生源（biogen），一般直接或间接来源于代谢中间物或初级代谢物，可直接作为合成的前体，也可修饰之后用于合成次级产物，虽然次级代谢产物种类繁多，但生源只有几种。,（1）、聚酮体 （2）、糖类 （3）、氨基酸 （4）、非核酸类的嘌呤、嘧啶碱基 （5）、莽草酸 （6）、甲羟戊酸,（1）、聚酮体,含有多个羟基，基本单元为乙酸、丁酸、丙酮、乙酰辅酶a、丙酰辅酶A等，缩合脱羟最终形成多酮次甲基链，在该生源的基础上可得到四环素、蒽环类抗生素，环化后可生成大内酯环，不饱和多烯大环内酯。,（2）、糖类,次级产物，氨基糖、糖胺、核糖、环多醇、氨基环多醇。 1）、氨基糖：新霉素B，多烯大环内酯类； 2）、糖
11、胺：大环内酯类（红霉素）； 3）、环多醇：链霉素。,（3）、氨基酸,次级代谢产物中的多种非蛋白质氨基酸常用来合成肽类抗生素。短杆菌肽，杆菌肽， 不常见氨基酸：L鸟氨酸，D苯氨酸、D谷氨酸等。,（4）、非核酸类的嘌呤、嘧啶碱基,次级代谢产物中的非核酸的嘌呤碱基和嘧啶碱基是正常碱基经过修饰后得到的。 可用于合成核苷酸类抗生素，如嘧啶核苷酸类抗生素。,（5）、莽草酸,源自葡萄糖。 是许多芳香族化合物和某些多酚类化合物的前体。 如利福霉素。,（6）、甲羟戊酸,由乙酸代谢产生。 是异戊二烯类或萜类次级代谢产物的重要构建单位。 可用于合成赤霉素，生物碱，甾体，胡萝卜素。,2、次级代谢产物生物合成的 基本途
12、径,包括三个主要的途径： （1）、前体聚合 （2）、修饰 （3）、不同组分的装配,短杆菌肽的合成途径,四环素的合成,新生霉素的合成,第四节 抗生素生产实例,以青霉素的生产为例。 菌种：产黄青霉，按其在深层培养中菌丝的形态，可分为球状菌和丝状菌。,发酵工艺,培养基,碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖等。 氮源：玉米桨、花生餠粉、棉籽餠粉等。 前体：苯乙酸、苯乙酰胺，对青霉菌有毒性，一次加入量不可超过0.1。 无机盐：硫、磷、钙、镁、钾等。,发酵培养控制,加糖控制，根据残糖量和发酵过程中的pH变化进行控制。 补氮及加前体，硫酸铵、氨或尿素使发酵液氨氮控制在0.010.05。 pH，6.46.6，加糖来进行控制。 温度控制，前期2526度，后期23度，以减少后期发酵液中青霉素的降解。 通气与搅拌，溶解氧量不低于饱和情况下溶解氧的30。 泡沫与消沫，豆油、泡敌。,过滤,发酵液采用鼓式真空过滤器，过滤前加去乳化剂并降温。,提炼,溶媒萃取法。发酵液酸化至pH2，加13体积的醋酸丁酯，离心分离。然后以1.31.9碳酸氢钠在pH6.87.1时将青霉素从醋酸丁酯中提取到缓冲液中，再调pH至2.0后，将青霉素从缓冲液转入醋酸丁酯中。,脱色,在提取液中加入活性炭，吸附后过滤，得到无色滤液。,结晶,醋酸提取液共沸蒸馏直至结晶析出，过滤，将晶体洗涤后进行干燥得到成品。,
