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1、粘膜疫苗与活载体疫苗,2010/04/15,粘膜免疫,1963年Chodirker和Tomasi等对粘液Ig类型进行大量免疫化学研究发现一种IgA类抗体，导致了粘膜免疫概念的产生。,S-IgA 介导的胃肠道的免疫保护,粘膜免疫系统的组成,1 有结构的组织：称为黏膜滤泡，主要是肠相关淋巴组织和支气管相关淋巴组织。他们是免疫应答的传入淋巴区，抗原由此进入MIS（粘膜免疫系统），被抗原提呈捕获、处理和提呈给T、B细胞，引发免疫应答。 2 弥散淋巴组织：广泛的分布黏膜固有层中，它们是免疫应答的传出淋巴区，浆细胞和致敏淋巴细胞通过归巢机制迁至弥散淋巴组织，抗体和致敏淋巴细胞在此发挥功能。,粘膜免疫系统存
2、在着功能性分离的位点,诱导位点 (inductive site)：首次接触抗原/疫苗诱导起始反应的位点，肠相关淋巴组织 (GALT),支气管相关淋巴组织 (BALT)、鼻淋巴组织 (NALT)、眼结膜相关淋巴组织等。,效应位点 (effector site)：摄取抗原诱导B细胞和T细胞反应，引起免疫保护的位点，肠道、呼吸道和生殖道等粘膜的固有层、部分腺体 (乳腺、汗腺及禽哈德氏腺)和上皮间淋巴细胞(IEL)。,粘膜免疫,粘膜免疫系统存在着功能性分离的位点：,诱导位点 (inductive site)：首次接触抗原/疫苗诱导起始反应的位点，肠相关淋巴组织 (GALT),支气管相关淋巴组织 (BA
3、LT)、鼻淋巴组织 (NALT)、眼结膜相关淋巴组织等。,效应位点 (effector site)：摄取抗原诱导B细胞和T细胞反应，引起免疫保护的位点，肠道、呼吸道和生殖道等粘膜的固有层、部分腺体 (乳腺、汗腺及禽哈德氏腺)和上皮间淋巴细胞(IEL)。,肠道集合淋巴结(PP)对抗原的摄取,从功能上和形态学上，肠道集合淋巴结分为三个区: (1)弯隆区(dome region)，由含微皱褶细胞(M细胞)、滤泡相关上皮 (FAE)和淋巴细胞的上皮层覆盖; M细胞主要用于抗原转运到诱导位点。 (2) B细胞滤泡，常含一个或多个生发中心; (3) T细胞依赖区 (TDA)，富含T细胞。,肠道集合淋巴结引
4、发的IgA抗体反应,(1)正常的抗原递呈; (2)在Th细胞的辅助下，肠道集合淋巴结中B细胞对抗原刺激发生反应，进行扩增，形成记忆细胞，散布到粘膜效应位点如大、小肠的弥散性固有层。 （3）当归巢 至些效应位点，B细胞进行克隆扩增，一旦再接触到相同抗原，在Th细胞和其分泌的细胞因子的辅助下，分化为分泌IgA的浆细胞; （4）B细胞和Th 细胞经过这种诱导， 其子代迁移至效应位点如胃肠道的固有层继续发育， 这些过程构成了粘膜共有的免疫系统,肠道集合淋巴结引发的IgA抗体反应,怎样针对粘膜免疫诱导位点抗原递呈和激活B, T细胞亚群最佳？,必须弄清病原体的致病机理以及宿主如何反应来保护自己，才能设计最
5、佳方案 ：(1)目前选择使用的大量疫苗主要是特异性针对肠道集合淋巴结 包括口服混合有粘膜佐剂、微胶囊或活载体释放系统的抗原; (2)病原体是胞内感染，在设计疫苗时，更多地考虑刺激CD4+ Th1细胞和CD8 + T细胞，引发细胞免疫反应。 （3）病原体经细胞外机制引起疾病，应考虑疫苗的免疫程序来优化CD4 + Th2细胞，引发体液免疫;,新的粘膜免疫佐剂 神经肽,免疫系统有其自身的调节途径：经细胞间相互作用和释放细胞因子来控制B细胞和T细胞反应。 肠神经系统 (enteric nervous system, ENS)影响着胃肠道免疫系统的调节 ENS渗透到胃肠道的每个部位，波及广泛的区域，影响
6、着粘膜免疫的诱导和效应功能，涉及免疫应答的神经调制质 (neuro modulator)达18种以上。,新的粘膜免疫佐剂 神经肽,P物质能刺激产生Ig细胞的发育，体内排空P物质则降低产生Ig细胞的数目。含P物质的神经纤维的密度和分布在哺乳动物种间变化很大，进一步研究需要确定这种神经纤维是否直接影响固有层浆细胞或 T细胞。 血管活性肠肽 (VIP)：淋巴细胞表达 VIP 受体，含VIP神经纤维可渗透到肠道集合淋巴结的T细胞区。与P物质发挥的刺激作用相反，VIP通过降低IL-2而IgA产生的减少。 P物质和VIP如何互相调节粘膜免疫反应提供进一步的研究。,怎样针对粘膜免疫诱导位点抗原递呈和激活B,
7、 T细胞亚群最佳？,将疫苗导向粘膜诱导位点，沿着Th细胞途径驱动免疫反应，提供长期的免疫保护 (1) 可溶性蛋白质可特异性与肠道集合淋巴结的m细胞反应，但不能刺激S-IgA 抗体到保护水平，需要多次投放疫苗。 (2) 微胶囊代表了一种有效的抗原释放的时控机制 。单个剂量口服接种的微胶囊疫苗会表现免疫记忆反应。 （1）（2）只有10被吸收，将 CT-B,LT-B 连接到抗原上， 导向肠道集合淋巴结 M 细胞， 促进其吸收。 （3） 应用活载体释放系统是一种可行的办法。,活载体疫苗,构建活载体疫苗的细菌载体,构建活载体疫苗的病毒载体,构建活载体疫苗的细菌载体,减毒沙门氏菌、卡介苗、减毒肠致病性大肠
8、杆菌、减毒弧菌、减毒耶尔森氏菌 共栖菌的细菌包括革兰氏阳性菌格氏链球菌、木糖葡萄球菌、乳球菌、乳酸杆菌等也可代替减毒病原菌作为载体； 单核细胞增生李斯特菌最近也被认为是一种潜在的疫苗载体,释放粘膜疫苗的活载体沙门氏菌,(1)该菌能运送抗原至肠道的淋巴组织，并引起分泌IgA免疫反应，分泌性IgA浸润所有的粘膜表面以及外分泌腺体的分泌物。 (2)伤寒沙门氏菌在动物寄主肠道中定居，并在肠道淋巴组织、肝和脾中增殖。各种沙门氏菌突变后，它们仍能在肠道淋巴组织中定居。这些特征使减毒沙门氏菌可能作为表达各种定居因子、毒性抗原基因的载体，来递呈这些抗原到肠道淋巴组织。,释放粘膜疫苗的活载体沙门氏菌,(1)营养
9、缺陷质粒补救系统:该系统的寄主是某 一营养代谢物的染色体突变株，而转移质粒则带有与寄主突变互补的非同源基因。 (2)整合表达系统:即将外源基因整合到载体的染色体中。 (3)细胞表面表达系统:即将外源基因产物表达到载体细胞表面，有利于与免疫系统接触, (4)鞭毛表达系统:与鞭毛蛋白融合在一起的抗原蛋白也将存在与细胞表面，同样有利于与宿主的免疫系统接触。 目前还没有证据显示：一个表达位点 比另一个表达位点更有确定 的优点，应答的类型主要是依赖于抗原的性质。,释放粘膜疫苗的活载体沙门氏菌,沙门氏菌是通过肠细胞或m细胞侵袭至宿主体内，使它们易于接近免疫效应细胞或抗原提呈细胞，或直接刺激粘膜免疫系统 检
10、查沙门氏菌表达系统诱导的肠道集合淋巴结的Th反应比较困难，通过检查脾脏细胞的反应来证明粘膜反应。 表达硕大利什曼原虫 gp63表面蛋白质的致弱的沙门氏菌诱导的Th1样反应可通过从抗原刺激的脾脏细胞的培养上清液中IFN-r和IL-2的产生和IL-4的缺乏来实现。确定IgA诱导位点 (如肠道集合淋巴结)和效应位点 (如胃肠道固有层)中抗原特异的Th1和Th2细胞的特性已成为当前研究的一个热点,卡介苗,与牛分枝杆菌相近的分枝杆菌和丁酸分枝杆菌作为完全佐剂的关键成分已使用多年。 优点:(1)并发症少; (2)它和脊髓灰质炎疫苗是WHO组织所推荐的、出生时预防接种的两种疫苗，本身就是最强的非特异免疫刺激
11、剂;能应用与HIV阳性的新生儿; (3)单次免疫接种即能诱导长期的 (5-50年)细胞介导的免疫力，使机体产生对AIDS、肝炎甚至恶性肿瘤等20余种疾病的保护性免疫; (4) 价廉、热稳定性强，适宜在基层推广使用,卡介苗,将外源基因导入卡介苗中的技术很成熟 利用分枝杆菌噬菌体构建新的杂交穿梭载体，能象大肠杆菌的质粒一样起作用。 表面表达的抗原最有利于抗原的递呈以产生最佳免疫应答，尤其是提供免疫保护方面。 讫现在所做的工作为止，根据诱导的免疫应答还很难说一种途径比另一种途径更好。象沙门氏菌一样，应答更取决于抗原的类型而不是其免疫的方法。,共栖菌,许多G+菌表面蛋白是通过普通6肽结构连在细菌表面L
12、PXTGX ，用M6蛋白以融合蛋白的形式递呈不同的抗原构建载体。 共栖菌： （1）格氏链球菌 （2）木糖链球菌 （3） 乳球菌/乳酸杆菌,目前用于表达外源病毒蛋白的载体病毒包括： 痘病毒 (痘苗病毒和宿主特异性痘病毒)、 腺病毒、 疱疹病毒、 小RNA病毒等,构建活载体疫苗的病毒载体,痘苗病毒具有宿主范围广、增殖滴度高、稳定性好、基因组容量大、含多个非必需区基因等特，因此，有利于进行基因工程操作，易于构建和分离重组病毒，适于插人多个外源基因 (可达0kb)，对插入的外源基因有较高的表达水平。 禽类痘病毒，由于用该病毒接种哺乳动物后，可以引起顿挫型感染，可以持续表达外源基因，并且不影响再次接种，
13、日渐引起人们的关注。马立克氏病毒 gB基因的鸡痘活载体疫苗免疫效果极佳，免疫鸡用强毒攻击100%不发病，用超强毒株击90%不发病。病毒感染的广谱性，使其它痘苗病毒活载体疫苗的应用受到限制。,痘病毒,腺病毒载体对外源基因的容量较小，但它具有独特的优点: 腺病毒比较安全。 腺病毒的靶细胞范围广，不仅能感染复制分裂细胞，而且能感染非复制分裂细胞。 腺病毒容易制备，对热不敏感，在适合的培养系统中呈高滴度增殖。 腺病毒可以在肠道及呼吸道繁殖，能诱导粘膜免疫，能制成药囊经口服途径接种以预防消化道及呼吸道感染。 (5)Ad2, Ad5等启动子较强，能高水平表达外源基因，特别是换以更强的启动子。,腺病毒,大多
14、数腺病毒载体就是以Ad2和Ad5为基础构建的。重组腺病毒最大包装量约为野生型的105%，即外源基因的容量为20kb。 要插入大片段的外源基因就必须缺失一段腺病毒基因组。一般缺失位点有三处，即El, E3以及E4与反向末端重复之间的区域。 E3区可去除约2.2Kb构建成有复制能力的非缺陷型载体，允许插入的外源基因的最大长度为4.0Kb。一般不需要加基因表达调控元件，利用腺病毒本身的调节元件E3启动子在感染早期有效表达。,腺病毒,缺失E1区的人腺病毒必须在特殊的工程细胞中或非缺失的腺病毒辅助下才能复制增殖，因此称为病毒缺陷型载体。 “第一代腺病毒载体” (应包括E3或El + E3同时缺失) 目前
15、应用最为广泛，由于缺失复制必须区，腺病毒只能在表达El基因产物的细胞中复制。 E1区可被去除5.5Kb，外源基因的插人容量可达7.5Kb。常规的构建方法是在E1区插入一个表达盒，其中包括启动子，外源基因和polyA序列。,腺病毒,几乎所有的哺乳动物都存在疱疹病毒，某些疤疹病毒对畜牧业构成严重的危害，如伪狂犬病毒。 疱疹病毒的基因组较大，约150kb左右，预计含有约70个编码基因，其中至少有20%的基因是非必需基因，可容纳多个外源基因的插入。 许多疱疹病毒经粘膜途径感染，构建的载体活疫苗可经粘膜途径提呈抗原，诱导特异性粘膜免疫。 疱疹病毒活载体主要有单纯疤疹病毒、伪狂犬病毒、火鸡疤疹病毒、牛疤疹
16、病毒I型、马疤疹病毒I型和传染性喉气管炎病毒等,疱疹病毒,几乎所有的哺乳动物都存在疱疹病毒，某些疤疹病毒对畜牧业构成严重的危害，如伪狂犬病毒。 疱疹病毒的基因组较大，约150kb左右，预计含有约70个编码基因，其中至少有20%的基因是非必需基因，可容纳多个外源基因的插入。 许多疱疹病毒经粘膜途径感染，构建的载体活疫苗可经粘膜途径提呈抗原，诱导特异性粘膜免疫。 疱疹病毒活载体主要有单纯疤疹病毒、伪狂犬病毒、火鸡疱疹病毒、牛疱疹病毒I型、马疱疹病毒I型和传染性喉气管炎病毒等,疱疹病毒,火鸡疱疹病毒活载体，是禽病毒基因工程研究中比较活跃的领域。 用该载体表达新城疫病毒的F和HN基因，由此构建的重组病
17、毒接种鸡后，免疫鸡可抵抗新城疫病毒和马立克氏病毒强毒的攻击。 用该载体表达马立克氏病毒的gB基因，解决马立克氏弱毒苗不能冻干带来不便。 用伪狂犬病载体表达猪瘟病毒的El基因，免疫猪后既可预防伪狂犬病又可预防猪瘟。,疱疹病毒,小RNA病毒科中的脊髓灰质炎病毒 (PV) Sabin疫苗株在实际应用中证明安全、可口服，并且易增殖，感染滴度高。 可以将Pi区中的部分氨基酸缺失掉，代之以外源性病毒保护性抗原决定族，形成嵌合病毒粒子。 脊髓灰质炎病毒作为载体与前面所述的病毒活载体有所不同，前述载体系将外源性保护性抗原分泌到载体病毒粒子以外，而脊髓灰质炎病毒载体表达的外源性病毒蛋白则以嵌合的形式存在于载体病毒颗粒的表面。,
