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1、2018/9/21,1,蔗糖酶的分离提纯及酶促 反应动力学实验,（综合性大实验）课件制作、讲授及实验指导：郭慧云,2018/9/21,2,内容提示,本实验含如下内容（1、2、3是酶分离提纯及比活力测定部分的内容；4、5是酶促反应动力学部分的内容）： 1、 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS法）工作曲线的制作及三种蔗糖酶样品（E1、E2 、E3）的测定（酶活力）； 2、 Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作及三种蔗糖酶样品（E1、E2 、E3）的测定（蛋白质含量）； 3、蔗糖酶的分离提纯（细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、透析和离子交换柱层析装柱、上样、洗柱、洗脱、收集酶活力峰、保存）；
2、 4、蔗糖酶米氏常数的测定（用双倒数法）； 5、用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响（含实验设计及数据处理的相关知识）。,2018/9/21,3,一、目的要求,1.熟悉工作曲线的制作方法及使用注意事项； 2.学习掌握3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理和方法； 3.学习掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4.学习酶蛋白分离提纯的原理； 5.学习掌握细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、透析和离子交换柱层析技术； 6.学习掌握酶的比活力测定及其计算方法； 7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择确定酶促反应最适条件（温度、pH值、离子浓度等）的方法； 8.学习正交试验法中
3、最简单的入门知识：用正交表设计试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。,2018/9/21,4,二、实验原理,前 言酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比活力）及收率；依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、电荷、吸附等）进行分离; 胞内酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、分 离、纯化、测活、保存；用测定酶活力的方法跟踪酶的去向、 衡量酶提纯的程度和得率。酶促反应的动力学（反应速度及影响因素）: 1）底物浓度对酶促反应速度的影响 2）酶浓度对酶促反应速度的影响 3）pH值对酶促反应速度的影响 4）温度对酶
4、促反应速度的影响 5）激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响.,2018/9/21,5,2018/9/21,6,2018/9/21,7,2018/9/21,8,4、Folin-酚法测定蛋白质含量的原理：1）凡含有两个及两个以上肽键（CONH）的化合物（如双缩脲：H2NCONHCONH2），在碱性溶液中（如Folin-甲试剂）都能与Cu2+作用，形成紫色的复合物；2）蛋白质是由多个氨基酸通过肽键连接起来的，故所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应，形成紫色的铜-蛋白质复合物；3）铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸（Folin-乙试剂）还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深
5、浅（在一定范围内）与蛋白质的含量成正比； 在测定液体蛋白质样品含量的常用方法中（双缩脲法、 Folin-酚法和紫外吸收法），Folin-酚法的灵敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比双缩脲法高100倍），所以我们选用本方法。,2018/9/21,9,5、有机溶剂分级沉淀的原理：有机溶剂分级是利用不同Pr在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。其原理是：1）有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加Pr分子上不同电荷的引力，使蛋白质的溶解度下降；2）有机溶剂与水作用，能破坏Pr的水化膜，使蛋白质的溶解度下降。 6、离子交换柱层析的原理：是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分离
6、的技术。在分离过程中，以离子交换作用为主导；在众多的交换剂中，离子交换纤维素的优点是：,2018/9/21,10,1）有开放性的长链结构、较大的表面积，所以对Pr的吸附容量大； 2）纤维素上离子基团的数量不多且排列疏散，对Pr的吸附不是太牢固，所以用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起Pr的变性； 3）用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都不会发生体积的改变，所以有利于Pr的层析。本实验中使用的DEAE-c11是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。,2018/9/21,11,三、实验流程,周三晚上6：00开始
7、 周四下午1：00开始 1、制备蔗糖酶粗品E1 2、制作DNS比色定糖的工作曲线（当天画出工作曲线） 自溶 3、制作Folin-酚法测定蛋白质含量的工作曲线（当天画出工作曲线）抽提（过夜）,2018/9/21,12,4、乙醇分级和透析（制E2）离心得E1（无细胞抽提液） 取样、测定酶E1活力及蛋白质浓度 第一次乙醇分级（32%乙醇饱和度） 第二次乙醇分级（47.5%乙醇饱和度） 透析（过夜）,2018/9/21,13,5、柱层析的准备工作组装层析装置,装柱、柱平衡（过夜）,2018/9/21,14,6、 柱层析（制E3） 周五下1：00开始 离心（得E2 ） 取样、 测酶E2活力及蛋白质浓度
8、上样 洗柱（用目测酶活力的方法检测目的酶是否挂上） 洗脱 合并酶活力峰,得E3 保存成品E3 测酶E3活力及蛋白质浓度,2018/9/21,15,成品E3 计算出E3浓度周六（全天）上午8：00开始 (1).蔗糖酶米氏常数的测定 (2).用正交法测定几种因素对蔗糖酶 活力的影响,2018/9/21,16,四、操作步骤及注意事项,1、 DNS比色定糖法工作曲线的制作取11支血糖管编号111，按下页表中的顺序和数量加入葡萄糖标准溶液（0.2%）、蒸馏水、3，5-二硝基水杨酸试剂，混匀后同时放入沸水浴中准确反应5分钟（注意：一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管，且不要用大玻璃杯代替沸水浴锅；用秒表记
9、时），取出后立即用流动的冷水冷却，加蒸馏水定容至25ml，摇匀，测定540nm处的A值。以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出工作曲线。,2018/9/21,17,3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作,试号 含糖量 葡萄糖标准液 去离子水 3，5-二硝基水杨酸试剂 A540（mg） （ml） （ml） （ ml）1 0 0 2.0 3 2 0.4 0.2 1.8 33 0.8 0.4 1.6 34 1.2 0.6 1.4 35 1.6 0.8 1.2 36 2.0 1.0 1.0 37 2.4 1.2 0.8 38 2.8 1.4 0.6 39 3.2 1.6 0.4
10、310 3.6 1.8 0.2 311 4.0 2.0 0 3,2018/9/21,18,2、Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作取7支试管（干燥）按下表中顺序加入各种试剂并进行反应和测定以1号管为参比调零，记录光密度值A650，以标准液的浓度为横坐标， A650值为纵坐标，画出工作曲线。,2018/9/21,19,* Folin-酚法测定蛋白质含量的方法,1.样品的测定：取两支试管（平行）各加入样品液（稀释成一定浓度的）1ml ，其他操作（反应和比色测定）同工作曲线的制作（前页）2.蛋白质浓度的计算：A650值对应的g数(Pr)10-3 Pr (mg/ml)= 稀释倍数Pr溶液的ml
11、数,2018/9/21,20,*制作工作曲线的注意事项1.分光光度计的使用：1）测样时,光吸收值A应在0.1000.700之间，并小于标准曲线的最大值，否则，缩小or加大样品的稀释倍数，重测！2）其他，见（523室）操作规程； 2.比色杯的使用：1).洗净（洗净的标准是：透明、无痕迹、不挂水珠）后，置小烧杯内用蒸馏水浸没；2).用蒸馏水or buffer校正（方法在仪器室讲），然后在杯底标上记号（0、1、2、3）；3).向杯中加样液时，按浓度从低到高的顺序加，注意加样到比色杯的2/3处；4).如样液有外溢，先用滤纸条吸干（不许檫）；再用镜头纸向一个方向檫至透明；5).将装有参比、样品溶液的比色
12、杯放入比色杯架上时，要摆放在一条直线上；,2018/9/21,21,6).倒出液体后，一定要用洗瓶中的蒸馏水洗净，然后倒置在滤纸上吸干；7).任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上；8).自备废液杯（盛废液及废纸块用）；9).各台分光光度计的比色杯是配套的，不许随意调换使用。 3.工作曲线的制作（以Folin-酚法测定蛋白质含量的工作曲线为例）1）反应：取液量准确：移液管洗净、标号、润洗，最好同一人取样；温度准确：（恒温水浴中放有温度计），记时准确（用秒表）；所用的标准液、buffer、反应液应是同一批配制的； 加入Folin-乙试剂时要特别小心！因为Folin-乙试剂只有在酸 性条件下稳定，而
13、反应是在碱性溶液中进行，所以加入Folin-乙试剂后，一定要迅速摇匀（加一管摇一管）；,2018/9/21,22,2）测量： 由同一个人读数；制作标准曲线及测量样品使用同一台仪器； 3）记录： 实验记录本记录要清晰（不许用纸片），实验结束后要请教师签字； 记录仪器使用情况。 4）制图： 标明：曲线名称、纵横坐标的单位、仪器号、使用时间；注意实验点的分布、大小（依据误差）、直线的角度（最好在45度左右）；不许延长工作曲线（比耳定律适用于稀溶液中的反应）。 附：标准液的配制：浓度必须准确，要注意烘干、称量、定容等操作；分装or取液时防止被稀释！,2018/9/21,23,3、 蔗糖酶粗品（E1）的
14、制备自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀，再于35 恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象； 抽提：补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35 恒温过夜，8000r/min离心10min，弃沉淀及脂层，得E1（无细胞提取液）；量体积V1=（ ）ml（取出2ml置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活力及蛋白质浓度）。 4、乙醇分级和透析（制E2） 测E1pH、用稀HAC调pH至4.5（注意少量、慢加、搅匀，防止调过）； 第一次乙醇分级（32%乙醇饱和度）：计算出使E1的乙醇浓度达32%时，所需
15、95%乙醇的体积X1，将E1和乙醇X1，放入冰盐浴中预冷，在不断搅拌下，缓慢滴加乙醇，3000r/min，离心5min，弃沉淀，留上清；,2018/9/21,24, 第二次乙醇分级（47.5%乙醇饱和度）：同上法加入X2（为达47.5%乙醇饱和度时需要补加的95%乙醇的体积），离心3min，弃上清，沉淀立刻用10ml 0.005mol/L pH6.0的磷酸buffer溶解，并装入透析带（截止分子量一万的），对上述buffer透析过夜；次日，3000r/min离心3min，得E2，量体积V2=（ ）ml（留出2ml置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活力及蛋白质浓度），其他酶液准备上样。5. 柱层析（制E3） 装柱：本实验使用的层析柱是自加工的，用泡沫海绵为筛板。装入纤维素前，先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵,赶尽气泡并把柱子垂直固定；将纤维素用起始缓冲液调稀、搅允后加入，柱内的纤维素应非常均匀地分布，防止出现节面和气泡，床面要平整，床高距柱顶23cm为宜；用起始缓冲液洗柱,控制好流速（防止流干），于4平衡过夜。,
