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1、细菌耐药性监测与临床,省立医院检验科 李华,为什么要检测耐药菌,感染病原的变迁造成现代感染模式 耐药菌株的流行临床的需要(指导感染性疾病的个体化治疗，细菌的耐药性监测指导经验治疗),2007年肠杆菌属细菌耐药率（%）,2007年12家医院3988株铜绿假单胞菌耐药率（%）,2007年12家医院3157株不动杆菌属细菌的耐药率（%）,细菌产生耐药性的原因,分裂繁殖方式：以其二分裂繁殖方式使自身可在很短的时间里分裂繁殖，使自身增加数百亿万倍，有利于耐药性的播散。耐药机制的产生： 细菌可以通过多种耐药机制对抗生素产生耐药性，产生各种灭活酶、抗生素膜渗透障碍、靶位的改变等.,细菌产生耐药性的原因,抗菌
2、药物的发现和广泛应用 环境的原因 早在抗生素应用以前有些细菌就具有备抗药基因。细菌存在于地球上已有3乙多万年了，早在人工合成的抗生素使用之前，细菌就与自然界中的一些天然的抗菌成分以及其他微生物产生的抗菌物质广泛接触而获得了耐药基因。（放线菌的代谢产物、天然的植物、中草药等）。,菌产生耐药性的原因,自从青霉素（1942年在美国首次）应用于临床后2-3年内，75%的葡萄球菌对其产生了抗药性，目前葡萄球菌产酶株在95%-100%，对青霉素均耐药。1959年耐酶青霉素的合成并投入使用，仅2年时间1961年英国就报道分离出MRSA并且耐药菌迅速在世界扩散。目前我国临床实验室分离的金葡菌有近50% 的为M
3、RSA。,耐药菌产生的原因,耐药菌株被迅速选择和扩散： 1940-1960：青霉素时代 1960-1973:广谱青霉素、二代头孢时代 1978-1995：广谱内酰胺类、氟喹诺酮类 其结果：耐药菌株被迅速选择和扩散,菌产生耐药性的原因,在世界许多地方，抗生素使用于农业、渔业、林业水产及家禽养殖业中，在施肥与饲料中被常加入抗生素，这样做结果是大量杀灭了自然界中的敏感菌株而选择出了耐药菌株，这些耐药菌株最终可以通过食物链或直接接触传递给人。,细菌产生耐药性的原因,世界范围内迅速扩散人口密度过大 1万年前地球人口只有100200万，而现在已有60亿，人群之间有了更多接触机会；高度繁荣的旅游业、大量的旅
4、游流动人口，使在某一处发生的耐药菌可以没有国界地迅速地扩散到世界各地。,细菌产生耐药性的原因,正常情况下，每一类细菌产生的耐药性只发生于少数细菌中，难以与压倒多数的优势敏感菌竞争，故危害性较小，只有当敏感菌因抗生素的选择压力作用下而被大量杀灭后。耐药菌才大量繁殖而成为优势菌，并导致耐药菌的产生。因此，细菌耐药性的发生和发展是抗菌药物广泛应用尤其特别是无指征滥用的结果。,细菌产生耐药性的原因,现代医学的发展促进了耐药菌的产生 新的技术如静脉导管、人工瓣膜、介入治疗、切开引流、人工呼吸等，为一些机会致病菌提供了进入人体的通道，而这些机会致病菌比有毒力的致病菌更易产生耐药性。,细菌产生耐药性的原因,
5、此外，大量抗生素的发现使临床医生有过多的选择余地，所以在感染性疾病的治疗上很少强调改善宿主的功能，也不采用针对不同病原菌敏感的抗生素治疗，而一开始就选择使用广谱抗生素其，结果必然是导致了大量耐药菌株的产生。抗菌药物的使用不当同时也促进了耐药菌在机体内和医院环境中的定植繁衍，进而导致交叉感染和内源性感染日益增多。,细菌的耐药机制,遗传学机制： 染色体介导的耐药/突变耐药 质粒介导的耐药性/获得性耐药 生物化学机制表达： 产生灭活酶/钝化酶 抗生素渗透障碍 靶位的改变 其他机制 产生拮抗物 改变代谢状态、如呈休眠状态、营养缺陷等,细菌的耐药机制,临床病原菌产生的重要的水解酶,窄谱-内酰胺酶 -内酰
6、胺酶超广谱酶AMpC酶KPC酶 其他酶,临床上最重要的革兰阴性菌内酰胺酶,超广谱内酰胺酶（ESBLs）头孢菌素酶（ AmpC酶）碳青霉烯酶（KPC酶）,革兰阴性菌对内酰胺类药物的 耐药性及检测方法,内酰胺酶的分类 1耐药机制分类质粒介导 TEM、 SHV、 OXA等染色体介导TYPE(AmpC酶) 2分子生物学分类（Ambler)A、B、C、D四类 功能分类Bush分类1、2、3、4个组,超广谱内酰胺酶 Extended Spectrhm-lactamases,基本概念 （1） 主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆科细菌产生. （2）在体外试验中可使三代头孢和氨曲南的抑菌圈缩小，但并不一定在耐
7、药范围。 （3）加入克拉维酸可使抑菌圈扩大（对酶抑制剂敏感）。 （4）临床对内酰胺类药物（包括青霉素类和头孢类）耐药，但对碳青霉烯类和头霉烯类药物敏感。 （5）由质粒介导，往往由普通的内酰胺酶基因突变（TEM-1，TEM-2和SHV-1）而来。,ESBLs的发现和流行情况,产生基础 最常见的由质粒介导的内酰胺酶是TEM-1，TEM-2和SHV-1酶，这些酶仅对第一代头孢菌素有弱水解活性（广谱酶）。80年代中期，由于临床上广泛使用头孢类抗生素尤其是头孢他啶和头孢曲松，导致TEM-1和SHV-1内酰胺酶突变酶的出现。 首次发现 1982年，英国 1983年，德国 目前状况 肺炎克雷伯菌是产生ESB
8、L的最常见菌，产酶可高达40%以上，我院2007年肺炎克雷伯菌产ESBL达37%38%，大肠产酶达40%，肠杆科其他菌如产酸克雷伯菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌中也可分离到ESBL。,肠杆科细菌产ESBLs概况,TEM-1 最普遍 ,典型的情况是TEM-型和SHV-型的ESBLs由大的多重耐药质粒编码 ESBLs类型多且都有自己特异的底物和酶活性，是针对不同类型的广谱内酰胺类抗生素或内酰胺酶抑制剂产生的耐药 ,迄今已发现有上百种类型的ESBLs 肠杆科细菌大多都具产酶能力.,ESBLs流行特点,1、世界范围流行，但有区域性 2、确切的流行情况不清楚（耐药表型不明确，有不均一表现） 3、主要见于医
9、院感染 4、ESBLs的编码基因在质粒上，易造成在不同菌株中的播散， 5 、对酶抑制剂敏感； 对EDTA不敏感 ；,ESBLs的耐药机制,基因突变 耐药基因由质粒携带 ESBLs 多由普通的内酰胺酶基因发生突变而来。 GlySer-238突变引起酶的活性区扩大，导致对氧化亚氨基头孢菌素的亲和力和水解活性升高，体外诱变也证实第168和238位的置换可增强对氧化亚氨基内酰胺类抗生素的水解活性。,ESBLs耐药特点,1、青霉素类、一、二、三代头孢菌素、（部分可水解四代）和单环酰类抗生素均耐药2、对碳青霉烯类和头霉素类敏感3、对酶抑制剂敏感 4、产生ESBLs的细菌往往多重耐药。其质粒上常有氨基糖苷类
10、、氯霉素或TMP-SMZ等的耐药基因。（例有统计产酶株AMK70.37%耐药、CIP75.30%耐药；不产酶株分别为13.20%、35.81%）,产ESBLs细菌感染的临床表现,1、临床表现难以治愈的感染或反复复发的感染。2、三代头孢菌素治疗临床无效。,ESBLs表型的检测,筛选试验 标准纸片琼脂扩散法 MIC肉汤稀释法检测 双纸片协同试验 确认试验 纸片确认试验MIC肉汤稀释法仪器E-test PCR检测,标准纸片琼脂扩散法,培养基 ： Muller-Hinton琼脂 药敏纸片 头孢泊肟(10ug/片) 、头孢他啶、头孢曲松、 头孢噻肟和氨曲南（均为30ug/片）中 至少二种： 接种方法 标
11、准纸片扩散法 孵育条件、时间： 35、 空气、1618小时,标准纸片琼脂扩散法,判断标准 ： 头孢泊肟的抑菌环直径17mm 头孢他啶的抑菌环直径22mm 头孢曲松抑菌环直径25mm 孢噻肟和氨曲南抑菌环直径27mm有一种药敏纸片结果在此范围均应高度怀疑为产 ESBLs 株应进一步做确认试验， 报告方式：疑似产 ESBLs 株，所有的青霉素类、头孢菌素类（包括三、 四代头孢）单环酰胺类均视为耐药； 方法的局限性 易漏检,常规药敏试验：细菌对药物MIC/直径往往可能落在敏感范围，所以尽可能检测其耐药机制,检测ESBLS的意义,一旦诊断为产ESBLs所有的青霉素类、头孢菌素类（包括三、四代头孢）单环
12、酰胺类均视为耐药，无论体外试验是否敏感。,案例,患者，女，48岁，因尿频、尿急、肉眼血尿收住本院干部病房，临床诊断：尿路感染，给予三代头孢，静脉滴注一周，症状好转出院。一周后复发，再次入院，治疗同前，好转出院，再次复发。 细菌培养：大肠埃希菌，产ESBL 敏感的抗生素：亚胺培南、头孢西丁、呋喃妥因。 自购呋喃妥因治疗后没有复发。,头孢菌素酶(AmpC酶) Bush酶,基本概念: 1、 AmpC酶又称Bush酶，它的产生是由染色体上的AmpC基因所编码产生; 2、分类属Bush 型。 3、几乎所有的革兰阴性杆菌均可产生此酶，通常这种酶的表达水平很低，但在有诱导剂存在时，酶的产生会大大增加（表达水
13、平增加到10100倍），因此这类酶又叫诱导酶。,主要产酶菌株,绿脓杆菌 100% 吲哚阳性的变形杆菌 100%； 肠杆菌属： 80%； 枸橼酸杆菌属： 80%； 沙雷菌属： 80%； 沙门菌属： 80%,产生机制：,诱导：染色体AmpC基因通常处于关闭/抑制状态, AmpC 基因的编码作用被AmpD基因所抑制，当AmpD基因发生去抑制突变时（去阻遏）抑制作用被解除， AmpC基因编码产生高产AmpC酶。这个酶可以水解所有三代头孢菌素，并且不被酶抑制剂所抑制。 内酰胺类抗生素存在与环境中，与细菌细胞壁上的青霉素结合蛋白结合，PBPS 4、7a、7b被激活,三个 PBPS被激活就可启动AmpC基因
14、，诱导AmpC酶表达。活化因素就是抗生素。,头孢菌素酶(AmpC酶) Bush酶,诱导剂：内酰胺类抗生素 亚氨培南是潜在的酶诱导剂，但没有去阻遏用；许多三代头孢菌素是弱诱导剂，但有选择去阻遏作用；,AmpC酶分类,1、染色体AmpC酶：（Bush 内酰胺酶） 2、质粒型AmpC酶：近年来还发现了质粒介导的AmpC酶。上述的AmpC基因活化结果有两种表达： （1）可逆性 当去除诱导剂后，酶的表达水平将恢复到正常低基础水平（体制性表达）。称低产AmpC酶染色体介导。 （2）去阻遏 不可逆的，Amp基因活化是不可逆转的即使停止使用药物也仍然持续产生容易跳到质粒上称持续高产AmpC酶。,分型及检测方法
15、略,检测高产AmpC酶的意义,细菌一旦检测为高产AmpC酶，提示为多重耐药；对三代头孢菌素、及含酶抑制剂的复合抗生素治疗通常导致临床治疗失败；应选用碳青霉希类或第四代头孢或联合喹诺酮类（氨基糖苷类）治疗。,实验室对同一患者相同部位检出的同种病原菌，应每3-4天检测抗生素敏感性，以监测耐药机制产生（三代头孢SR，头孢西丁S R）专家系统药敏评注,碳青霉烯水解酶,基本概念 ：碳青霉烯水解酶是指所有能明显水解碳青霉烯的内酰胺酶，而不是单纯的“碳青霉烯酶”。,碳青霉烯水解酶的发现及流行特点：,20世纪90年代初，日本发现质粒介导的金属酶-IMP-1，可在细菌之间转移。 1996年日本17家医院的研究中
16、发现，0.4%的铜绿假单胞菌带有IMP-1基因。 不久在意大利的一株鲍曼不动杆菌和新加坡的一株肺克菌中也发现了该类酶。 法国的一株铜绿假单胞菌中发现的质粒介导的金属酶VIM-2，与意大利一株铜绿假单胞菌中发现的VIM-1具有高度同源性，编码VIM-1的基因位于转座子上。 近年来由于产ESBLS和AmpC酶的菌株增多引起碳青霉烯类抗生素的临床应用增加，可以预测世界其它地区亦可能出现产碳青霉烯酶菌株的流行。,什么是KPC酶？,国内： 已在肠杆菌科的多个菌属中有报道。 肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、沙门菌属、弗劳地柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌等。 该类酶除阴沟肠杆菌可有染色体介导外，其他各类细菌均可为质粒介导，已成为临床治疗难题,
