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1、,HPLC色谱知识及应用,反相分配色谱 极性:固定相 流动相固定相 - 极性流动相(己烷, 庚烷)- 非极性极性物质后出峰,正相色谱 20%,反相色谱 80%,正相 &反相色谱,硅胶基质- pH 38Al2O3 . nH2O - pH114聚合物基质 - pH114,高或低pH下, 硅胶会溶解,化学修饰困难,孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损,柱填料基质,硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度 色谱柱尺寸 填料床的长度和内径 颗粒形状 球型或不规则型 粒径 平均颗粒直径, 通常3-10m 表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gram表
2、示 孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300,色谱柱物理性质,C-18柱-性能影响因素,键合类型 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连 碳覆盖率 键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。 封端 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来,色谱柱化学性质,C-18柱-性能影响因素,A类硅胶 Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾,B类硅胶 (高
3、纯) ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾,C-18柱-性能影响因素,色谱柱尺寸 - 对色谱分离的影响 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高,C-18柱-性能影响因素,颗粒形状 - 对色谱分离的影响 当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时, 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命,C-18柱-性能影响因素,球形,不规则形,粒径 - 对色谱分离的影响 较小的颗
4、粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5m粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5m的粒径,1.8m 3.5 5m 7m 10m,表面积 - 对色谱分离的影响 高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要,C-18柱-性能影响因素,孔径 - 对色谱分离的影响 大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善峰形样品 MW 4, 000, 选择 80 的孔径 样品 MW 4, 000, 选择 300 的孔径,键合类型 - 对色谱分离的影响 单齿键合： 提高传质速率,
5、 加快色谱柱平衡双齿键合： 增加色谱柱稳定性, 增加色谱柱的载样量,C-18柱-性能影响因素,碳覆盖率- 对色谱分离的影响 高碳覆盖率：提高分辨率, 分析时间长 低碳覆盖率：缩短运行时间,封端 - 对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象 对于极性样品, 未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异,C-18柱-性能影响因素,固定相键合 二甲基硅烷,封端 四甲基硅烷,Si,O,OH,O,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,R = C8,C18,etc,.,O,OH,OH,O,CH,3,Si
6、,R,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,+,+,Cl,CH,3,Si,CH,3,CH,3,OH,OH,OH,OH,CH,3,Cl,R,CH,3,(,TMS),传统键合及封端技术,键合相种类,化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。 极性键合相：氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)常用作正相色谱，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。 非极性键合相：各种烷基(C1C18)和苯基、苯甲基，极性弱的组分保留值较大 。,HPLC-色谱柱与pH的关系,（可用于100%全水相）,未封端,双封端,三封端,双封端,HPLC-保留值与pH的关系,pH
7、变化值 0.1,RS变化值1.6,色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6 X 250mm, 5um 流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH 2.5 & 2.6 温度：500C 流速： 1.0mL/min.,邻氯苯胺（pKa2.636),色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C84.6 x 75 mm, 3.5 m 流动相: 44% 25 mM磷酸, pH 7.00 : 56% 甲醇 流速: 1.0 mL/min 温度: 25C 检测: UV 250 nm,可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 甚至很小的 0.050.25 个pH变化单位.,样品: keto
8、profen ethyl paraben Hydrocortisone fenoprofen propyl paraben Propranolol (游离碱pka 9.5） ibuprofen,HPLC-保留值与pH的关系,0.25 个pH,HPLC-保留值与pH的关系,pH变化： 0.2个pH(7.07.2) 保留时间改变： 1.2分钟 (13.614.8分钟),保留时间随pH 改变不明显,保留时间随pH改变 不明显(酸性环境中),（PKa：2.98）,（PKa：10.1）,方法稳定区 方法波动区(pKa+1.5) 方法稳定区,HPLC-保留值与pH的关系,复杂组分的流动相pH选择技巧,色谱
9、柱: ZORBAX Extend-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 30% 缓冲液: 70% MeOH pH 7 缓冲液20 mM Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM TEA 流速: 1.0 mL/min 温度: RT 检测器: UV 254 nm,0 5,1,2, 3,4,5,Time (min),7,6,Extend-C18 pH 7,1. Maleate 马来酸盐 2. Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 3. PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4. Doxylamine 抗敏安(多西拉敏) pKa 9.2 5. Ch
10、lorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1 6. Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5 7. Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0,Extend-C18 pH 11,0 5 10,1,2,3,4,Time (min),6,5,7,高pH下, 碱性成分的保留增加,待测物pKa+1.5以外 的流动相pH 可保证方法的稳定性,样品溶剂溶解强度,样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰,中性分析时为何要使用缓冲液？,色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 75 mm, 3.5 m 流动相: 44% A : 56%
11、甲醇 流速: 1.0 mL/min 温度: 25C 检测: UV 250 nm,含缓冲液的流动相可改善保留, 分离和色谱峰峰形.,样品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. propranolol 7. ibuprofen,A = pH 7.0水,A = pH 7.0 水+25 mM 磷酸缓冲液,增加缓冲液浓度减少拖尾,色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C84.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 40% 磷酸盐缓冲液60% ACN 流速: 1
12、.5 mL/min. 温度: 40C,USP Tf 1.62 1.65 1.63 1.77 1.83 1.12,10 mM 磷酸盐 pH 7.0,USP Tf 1.41 1.50 1.33 1.39 1.36 1.00,25 mM 磷酸盐 pH 7.0,在中等pH下, 离子强度较高, 能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾,样品: Tricyclic Antidepressants （三环抗抑郁剂） 1. Desipramine（脱甲丙咪嗪） 2. Nortriptyline（去甲替林） 3. Doxepin（多塞平） 4. Imipramine（丙咪嗪） 5. Amitriptyline（阿米替
13、林） 6. TrImipramine（三甲丙咪嗪）,三乙胺对碱性成分峰形的影响,0 2.5 5.0,Time (min),1,2,3,4,5,色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 85% 25 mM Na2HPO4 : 15% ACN 流速: 1.0 mL/min. 温度: 35C,USP TF 5% 1. 1.29 2. 1.33 3. 1.63 4. 2.35 5. 1.57,No三乙胺,10 Mm 三乙胺,USP TF 5% 1. 1.19 2. 1.18 3. 1.20 4. 1.26 5. 1.14,pH 7,样品:1. Phenylpropanolamine （去甲麻黄碱） 2. Ephedrine（麻黄素） 3. Amphetamine（苯丙胺） 4. MethAmphetamine（脱氧麻黄碱） 5. Phenteramine （苯丁胺）,竞争酸对酸性组分的峰形的影响,色谱柱: ZORBAX StableBond SB-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 40% A: 60% ACN 流速: 1.0 mL/min. 温度: 室温样品: Ibuprofen（异丁苯丙酸） pKa 4.4,
